Dacă, pe baza anumitor simptome ale plantelor și a rezultatelor examinării microscopice, se suspectează că agentul cauzal al bolii este o bacterie, următorul pas ar trebui să fie izolarea acesteia.
În acest caz, se presupune că agentul patogen este contaminat cu organisme însoțitoare, adică există o populație mixtă. Pentru a obține agentul patogen sub forma unei colonii de creștere separată, maceratul de țesut ar trebui să fie striat pe mediu.
Semănat cu o atingere. Folosind o ansă de inoculare calcinata, se ia o cantitate mică de macerat de țesut vegetal care conține bacterii și, cu mișcări ușoare, fără a deteriora suprafața agarului, se aplică 4-6 mișcări pe mediul nutritiv preparat. După ce a recalcinat bucla, cupa cu mediu este întoarsă cu 90° la dreapta și apoi se aplică încă 4-6 mișcări din a doua lovitură, acul este calcinat din nou și se efectuează a treia însămânțare. Se realizează o diluare a materiei prime astfel încât bacteriile, după incubarea într-un termostat timp de 48-72 ore la 28 °C, formează colonii individuale de diferite forme și culori. Coloniile sunt apoi transferate în tuburi înclinate de agar pentru examinare ulterioară. Folosind o buclă calcinată, luați o colonie și aplicați-o pe agar nutritiv cu o mișcare atentă sub forma unui șarpe sau în zig-zag.
Metoda de turnare Koch. Metoda plăcii Koch asigură că fiecare colonie este formată dintr-o singură celulă bacteriană. Cel mai bine este să preparați o suspensie din materia primă în apă sterilă și să utilizați metoda Koch numai cu această diluție. O cantitate mică din suspensie este transferată în prima eprubetă cu un mediu nutritiv răcit la 60 °C. Apoi conținutul tubului este amestecat cu inoculul prin rotirea acestuia între palme. Apoi, luați o a doua eprubetă, deschideți-o cu atenție peste flacăra arzătorului și folosiți bucle mari pentru a transfera trei părți ale substratului în ea din prima eprubetă. După arderea gâtului și a dopului, conținutul eprubetei este turnat în primul vas Petri, deschizând capacul vasului suficient pentru a introduce gâtul eprubetei sub acesta. Imediat după turnare, închideți cana și distribuiți cu grijă mediul nutritiv uniform.
După ce ați amestecat bine conținutul celei de-a doua eprubete, luați o a treia eprubetă și transferați șase părți ale substratului din a doua în ea cu o buclă. Conținutul eprubetei se toarnă într-o cană, iar conținutul eprubetei, după amestecare, se toarnă în cană. Vasele cu mediu sunt incubate într-un termostat la 28°C după câteva zile, bacteriile conținute în materialul de pornire formează colonii;
Creștere în serie. Dacă, de exemplu, este necesară izolarea bacteriilor din sol, atunci se utilizează diluția în serie. Mediul nutritiv steril (15 ml per cană) se toarnă în cupe, 0,1 ml din ultimele trei diluții ale suspensiei se aplică pe agar întărit și se întinde pe suprafață cu o spatulă de sticlă.
Pentru a izola bacteriile, 1 g de sol se suspendă în 9 ml de apă, se agită bine, se lasă să se depună câteva secunde, iar din suspensie se prepară diluții în serie. Folosind această metodă, se poate determina numărul de microorganisme din fiecare probă.
Dacă găsiți o eroare, evidențiați o bucată de text și faceți clic Ctrl+Enter.
Medicul și omul de știință german Robert Koch (1843-1910) a primit Premiul Nobel pentru munca sa microbiologică împotriva tuberculozei. El a creat, de asemenea, multe metode fundamentale pentru cercetarea microbiologică, dintre care unele sunt folosite și astăzi.
Munca vieții
La sfârșitul secolului al XIX-lea, tuberculoza a ucis aproape o treime din toți adulții de vârstă mijlocie din Europa. Medicii și oamenii de știință din acea vreme au făcut numeroase încercări de a găsi un leac. Koch Robert nu a făcut excepție, lupta împotriva acestei boli grave a devenit misiunea lui, opera întregii sale vieți. În ciuda faptului că a făcut progrese enorme în identificarea și potențialul tratament al acestei boli, primind chiar și Premiul Nobel pentru Medicină pentru această lucrare, omul de știință nu a încetat niciodată să îmbunătățească metodele de cercetare care au avut un impact major asupra întregii microbiologie.
Tineretul și alegerea profesiei
Părinții viitorului om de știință erau niște mineri săraci care erau uimiți de ce le-a dat soarta un băiat capabil. Născut în 1843 în Clausthal (Germania), Heinrich Hermann Robert Koch a fost un adevărat copil minune în copilărie. La vârsta de cinci ani citea deja ziare, iar puțin mai târziu s-a interesat de literatura clasică și era expert în șah. Interesul meu pentru știință a început în liceu, unde am ales biologia ca materie preferată.
În 1866, la vârsta de 23 de ani, Heinrich Robert Koch și-a primit diploma de doctor și și-a petrecut următorul deceniu lucrând ca medic în diferite societăți științifice din spitale și guvernamentale. În 1876, a publicat cercetările sale majore asupra bolii antraxului, care i-a adus faima pe scară largă. Câțiva ani mai târziu a fost numit consilier la biroul de sănătate, unde și-a petrecut cea mai mare parte a timpului ocupându-se de probleme legate de tuberculoză.
Determinarea cauzei tuberculozei
Medicina modernă cunoaște multe cauze ale majorității bolilor. Pe vremea când a trăit Koch Robert, această cunoaștere nu era atât de comună. Una dintre primele descoperiri importante ale omului de știință a fost identificarea Mycobacterium tuberculosis, care provoacă această boală fatală. Robert Koch, în timp ce studia cauzele infecției, a infectat în mod deliberat cobai cu material de la unul dintre cele trei animale infectate: maimuțe, vite și oameni. Ca urmare, s-a constatat că bacteriile porcilor infectați erau identice cu cele cu care au fost infectați, indiferent de sursa de infecție.
postulatele lui Koch
Ce contribuții a adus Robert Koch microbiologiei? Una dintre cele mai influente metode a fost propunerea ca agentul cauzal al unei boli să poată fi identificat cu un grad ridicat de încredere dacă erau îndeplinite patru condiții, care mai târziu au devenit cunoscute sub numele de postulatele lui Koch. Aici sunt ei:
- Microorganismul ar trebui să provoace boli în toate organismele în care este prezent din abundență, prin urmare nu ar trebui să fie prezente în organismele neinfectate.
- Microbul suspectat trebuie izolat și crescut în forma sa pură.
- Reintroducerea microbilor ar trebui să provoace boală în organismele neinfectate anterior.
- Microbul suspectat trebuie re-izolat din organismul de testat, crescut în formă pură și identic cu microbul izolat inițial.
Fondator al bacteriologiei și microbiologiei
Printre bolile studiate de medicul german Robert Koch (antraxul în 1876 și tuberculoza în 1882), s-a numărat și holera în 1883. În 1905, omul de știință a primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină. Pe când era încă student la medicină, Heinrich Hermann Robert Koch a avut un mare interes pentru patologie și boli infecțioase. Ca medic, a lucrat în multe orașe mici din Germania, iar în timpul războiului franco-prusac (1870-1872) s-a oferit voluntar pe front ca chirurg militar.
Mai târziu a fost numit lucrător medical local, a cărui principală responsabilitate era să studieze răspândirea bolilor bacteriene infecțioase. Aplicarea biotehnologiei în medicină se bazează încă în mare măsură pe principiile lui Koch pentru a documenta cauzele bolilor infecțioase. Marele om de știință a murit în 1910 în regiunea Pădurea Neagră (Germania), avea 66 de ani.
Cercetarea antraxului
Pe vremea când a trăit Robert Koch, antraxul era larg răspândit printre animalele de fermă din zona Wöllstein. Omul de știință nu avea în acel moment niciun echipament științific, bibliotecile și contactele cu alți oameni de știință erau inaccesibile. Cu toate acestea, acest lucru nu l-a oprit și a început să studieze această boală. Laboratorul lui era un apartament cu 4 camere, care era casa lui, iar echipamentul lui principal era un microscop, cadou de la sotie.
Bacilii Pollender, Rayer și Davaine fuseseră anterior descoperiți ca agenți cauzali ai antraxului, iar Koch și-a propus să demonstreze științific că acest bacil a fost de fapt cauza bolii. El a inoculat șoareci folosind așchii de lemn de casă cu bacili de antrax prelevați din splina animalelor de fermă care muriseră din cauza bolii. S-a descoperit că moartea rozătoarelor s-a produs tocmai ca urmare a pătrunderii infecției în sângele animalelor. Acest fapt a confirmat descoperirile altor oameni de știință care au susținut că boala ar putea fi transmisă prin sângele animalelor care suferă de antrax.
Bacilii antraxului sunt rezistenți la mediul extern
Dar acest lucru nu l-a mulțumit pe Koch. De asemenea, a vrut să știe dacă acești microbi ar putea provoca boli dacă nu ar fi fost niciodată în contact cu vreun fel de organism animal. Pentru a rezolva această problemă, a obținut culturi pure de bacili. Robert Koch, studiindu-i și fotografiendu-i, a ajuns la concluzia că în condiții nefavorabile produc spori care pot rezista lipsei de oxigen și altor factori negativi pentru bacterii. Astfel, ei pot supraviețui în mediul extern destul de mult timp, iar atunci când se creează condiții adecvate, vitalitatea lor este restabilită, din spori ies bacili, capabili să infecteze organismele vii în care intră, în ciuda faptului că au avut anterior. nici un contact cu ei.
Robert Koch: descoperiri și realizări
Rezultatele muncii sale minuțioase asupra antraxului i-au fost demonstrate de Koch lui Ferdinand Cohn, profesor de botanică la Universitatea din Breslau, care și-a adunat colegii pentru a asista la descoperire. Printre cei prezenți s-a numărat și profesorul de anatomie patologie Konheim. Toată lumea a fost profund impresionată de munca lui Koch, iar după publicarea unei lucrări pe această temă într-un jurnal botanic în 1876, Koch a devenit imediat celebru. El a continuat, totuși, să lucreze pentru Wöllstein încă patru ani, iar în această perioadă și-a îmbunătățit metodele de înregistrare, colorare și fotografiere a bacteriilor.
Viața la Berlin
Mai târziu, deja la Berlin, a continuat să îmbunătățească metodele bacteriologice, precum și să inventeze altele noi - creșterea bacteriilor pure în medii solide, cum ar fi cartofii. Domeniul în care Robert Koch a continuat să lucreze, microbiologia, a rămas specialitatea sa îngustă până de curând. El a dezvoltat, de asemenea, noi metode de colorare a bacteriilor care le-au făcut mai vizibile și au ajutat la identificarea lor. Rezultatul tuturor acestor lucrări a fost introducerea unor metode prin care bacteriile patogene pot fi obținute simplu și ușor în cultură pură, lipsite de alte organisme și prin care pot fi detectate și identificate. La doi ani după sosirea la Berlin, Koch a descoperit bacilul tuberculozei, precum și o metodă de cultivare a acestuia în forma sa pură.
Combaterea holerei
Koch era încă ocupat să lucreze împotriva tuberculozei când, în 1883, a fost trimis în Egipt ca lider al unei comisii germane pentru a investiga un focar de holeră în acea țară. Aici a descoperit Vibrio, care provoacă boala, și a adus culturi pure în Germania. El s-a ocupat și de o problemă similară în India. Pe baza cunoștințelor sale despre biologia și modul de răspândire a Vibrio cholerae, oamenii de știință au formulat reguli pentru combaterea epidemiei, care au fost aprobate de Marile Puteri la Dresda în 1893 și au stat la baza metodelor de control care sunt utilizate și astăzi.
Numirea în funcții înalte
În 1885, Robert Koch, a cărui biografie provine dintr-un oraș mic și dintr-o familie săracă, a fost numit profesor de igienă la Universitatea din Berlin. În 1890 a fost numit chirurg general, iar în 1891 a devenit profesor emerit al Facultății de Medicină și director al noului Institut de Boli Infecțioase. În această perioadă, Koch a revenit la munca sa în lupta împotriva tuberculozei. A încercat să oprească boala cu un medicament pe care l-a numit tuberculină, creat din micobacterii. Au fost create două versiuni ale medicamentului. Primul dintre acestea a provocat imediat controverse semnificative. Din păcate, puterea de vindecare a acestui medicament a fost mult exagerată, iar speranțele puse asupra lui nu erau justificate. Noua tuberculină (a doua versiune) a fost anunțată de Koch în 1896 și valoarea ei medicinală a fost, de asemenea, o dezamăgire, dar a dus totuși la descoperirea unor substanțe cu valoare diagnostică.
Și apoi ciuma, malaria, tripanosomiaza...
În 1896, Koch a călătorit în Africa de Sud pentru a studia originile pestei bovine. În ciuda faptului că cauza acestei boli nu a putut fi descoperită, a fost posibilă limitarea focarului. Aceasta a fost urmată de lucrări în India și Africa privind malarie, febră Blackwater, tripanosomiază și pesta bovină. Publicarea observațiilor sale asupra acestor boli a avut loc în 1898. La scurt timp după întoarcerea sa în Germania, călătoriile sale în jurul lumii au continuat. De data aceasta a fost Italia, unde a confirmat munca lui Sir Ronald Ross asupra malariei și a efectuat lucrări utile privind etiologia diferitelor forme de malarie și controlul lor cu chinină.
Contribuție la microbiologie: premii și medalii de onoare
În ultimii ani ai vieții sale, Koch a ajuns la concluzia că bacilii care provoacă tuberculoza la oameni și la bovine nu sunt identici. Declarația sa de la Congresul Medical Internațional împotriva Tuberculozei de la Londra în 1901 a stârnit multe controverse, dar acum se știe că punctul de vedere al lui Koch era corect. Munca sa asupra tifosului a dus la ideea că boala se transmite mult mai des de la persoană la persoană decât din apa de băut, iar acest lucru a condus la noi măsuri de control.
În decembrie 1904, Koch a fost trimis în Africa de Est pentru a studia febra vitelor, unde a făcut observații importante nu numai asupra bolii, ci și asupra speciilor patogene Babesia și Trypanosoma și a spirohetozei transmise de căpușe. Profesorul Robert Koch a primit numeroase premii și medalii, membru de onoare în societăți științifice și academii din Berlin, Viena, Napoli, New York și altele. A fost distins cu Ordinul German al Coroanei, Marea Cruce a Ordinului German Vulturul Roșu. Într-o serie de țări au fost ridicate memoriale și monumente în onoarea marelui microbiolog. Dr. Koch a murit la 27 mai 1910 la Baden-Baden.
Germania a produs multe minți științifice inovatoare de-a lungul secolelor, unul dintre cei mai mari oameni de știință ai timpului său fiind Robert Heinrich Hermann Koch, care a pus bazele studiului bacteriologiei și a ajutat la explicarea cauzelor și posibilelor tratamente pentru diferite boli bacteriene.
A fost un cercetător neînfricat, deoarece a fost responsabil pentru realizarea unor eforturi fără precedent pentru a studia bolile care pun viața în pericol, cum ar fi antraxul, tuberculoza și multe altele. Acest om de știință erudit a jucat și un rol important în crearea laboratoarelor moderne. Robert Koch nu a fost doar un om de știință talentat, a fost un geniu, iar numărul de premii și medalii pe care le-a primit de-a lungul vieții servește drept cea mai bună dovadă a contribuției pe care a adus-o la știința medicală mondială.
O cultură pură este o colecție de microorganisme aparținând aceleiași specii. Obținerea acestui material este un punct necesar de cercetare în implementarea tehnicilor de diagnostic de laborator. Pentru a izola culturile pure de bacterii, se folosesc frotiuri din sânge, spută, fecale și se examinează material purulent și alt material biologic. În condiții naturale (aer, apă, sol), produse alimentare și cadavre (umane, animale) există asocieri de diferite tipuri de microorganisme.
Separarea culturii pure este importantă pentru un studiu detaliat al proprietăților microbilor: morfologice, culturale, biochimice și antigenice. Pe baza rezultatelor acestor metode de cercetare se poate stabili că agentul patogen aparține unei anumite specii și tip, cu alte cuvinte, să se efectueze identificarea acestuia.
Principiile separării biologice a bacteriilor presupun luarea în considerare a caracteristicilor activității de viață a microbilor pentru a selecta cele mai optime metode de cercetare. Metodele selectate trebuie să se potrivească cu agentul patogen în funcție de anumiți parametri.
- Tipul de respirație. Dintre bacterii, se disting grupuri de reprezentanți aerobi și anaerobi. Pentru a obține microbi anaerobi, materialul pentru cercetare este încălzit. Următoarea etapă este cultivarea microbilor în condiții anaerobe. Metodele de obținere a bacteriilor aerobe și anaerobe sunt diferite.
- Sporularea. Capacitatea unor bacterii de a forma spori asigură protecția și conservarea microorganismelor.
- Rezistența bacteriilor la efectele agresive ale alcalinelor și acizilor. Rezistența unor tipuri de bacterii la aceste substanțe asigură purificarea maximă a materialului de testat de impuritățile altor bacterii folosind soluții alcaline sau acide.
- Motilitatea organismelor bacteriene. Pentru a separa o cultură pură de microorganisme mobile, se folosesc metode de separare a culturilor microbiene într-o picătură de condensat.
- Sensibilitatea microorganismelor la antibiotice, unele substanțe chimice și alți agenți antimicrobieni. Pentru unii agenți patogeni, cele mai preferate metode pentru izolarea culturilor folosind medii nutritive selective (specifice).
- Antibiotice. Curățați materialul de microorganisme suplimentare.
- Capacitatea bacteriilor de a pătrunde în pielea intactă. Această proprietate este inerentă unor soiuri care au factori de agresiune.
- Sensibilitatea animalelor la unele boli de origine infecțioasă.
Tehnici de evaluare a agenților patogeni
O serie de metode sunt utilizate pentru a obține culturi pure de celule bacteriene. Fiecare dintre ele este utilizat într-o situație particulară și are etape succesive clare de obținere a coloniilor de agent patogen. Să ne uităm la cele mai populare.
tehnica lui Pasteur
Reprezintă diluarea culturilor pure într-un mediu pentru creșterea bacteriană (consistență lichidă) pentru a obține o concentrație de 1 celulă pe volum de lichid. Această metodă de izolare are o mare importanță istorică.
Tehnica Koch
Cunoscută și sub denumirea de tehnică de „cablare a plăcii”. Este o diluare a materialului pentru cercetare în agar (în stare topită la o temperatură de 48-50°C). Apoi, compoziția rezultată este turnată în vase Petri, unde ar trebui să se întărească.
Inoculările se efectuează de obicei din ultimele 3-4 diluții, deoarece există deja puține bacterii acolo. Astfel, atunci când microbii cresc pe un mediu nutritiv, apar colonii izolate de microorganisme, care se nasc dintr-o singură celulă mamă. Apoi puteți selecta o colonie izolată din adâncimea agarului și o puteți transfera într-un mediu nutritiv proaspăt. Următoarea etapă este identificarea și izolarea agentului patogen.
tehnica lui Shukevici
Se utilizează atunci când este necesară izolarea unei culturi pure de aerobi Proteus sau a oricăror alți microbi caracterizați prin creștere „târâtoare”. Semănați culturile pe apă condensată la baza oblicului de agar.
Cu această metodă de separare a unei culturi pure, organismele celulare mobile (Proteus) se ridică în partea superioară a oblicului de agar, iar formele imobile nu își schimbă locația pe mediul de inoculare. Prin reînsămânțarea marginilor superioare ale culturii germinate se poate obține o cultură bacteriană pură.
tehnica lui Drigalsky
Metoda Drigalski este folosită pe scară largă în studiul materialului biologic prin diluarea culturilor într-o eprubetă cu bulion sau ser fiziologic.
Următorul pas: o picătură din soluția rezultată este distribuită uniform pe suprafața mediului alimentar din prima cană folosind o spatulă de sticlă sterilă. Apoi, fără să ardă spatula pe foc, o seamănă pe al 2-lea și al 3-lea vas. Esența metodei Drygalsky este că, cu fiecare însămânțare ulterioară a culturilor, concentrația de bacterii (aerobi) devine din ce în ce mai mică. Pe placa a 3-a sunt distribuite destul de separat, fiecare celulă bacteriană dând naștere la celule clonale (sub forma unei colonii izolate). Ele sunt subcultivate pe agar-agar pentru a acumula agenți patogeni.
Tehnica Weinberg
Izolarea culturilor pure de agenți patogeni anaerobi provoacă anumite dificultăți dacă microorganismele nu mor la contactul cu moleculele de oxigen. Esența tehnicii este îndepărtarea microbilor anaerobi (din material) într-un mediu alimentar topit ușor răcit (45-50°C) (agarosat). Se efectuează 6-10 diluții. Apoi urmează următorul pas: este necesar să se răcească rapid compoziția în eprubetă și să se umple suprafața acesteia cu un amestec de vaselină și ulei de parafină, care împiedică pătrunderea aerului și favorizează dezvoltarea condițiilor anaerobe.
Dacă semănatul este favorabil, în a doua zi germinează colonii izolate, care pot fi îndepărtate din eprubetă prin încălzirea acesteia cu un arzător. Din coloana de agar tăiată, culturile sunt colectate folosind o buclă pentru cercetări ulterioare. Coloniile rezultate sunt plasate într-un mediu nutritiv lichid, moment în care etapele de izolare a unei colonii de agenți patogeni anaerobi pot fi finalizate.
Tehnica Hungate
Este adesea folosit pentru a izola microbii aerobi care sunt foarte sensibili la oxigen. Pentru a realiza această izolare a culturii aerobe se utilizează tehnica eprubetelor rotative.
Metodele de inoculare a bacteriilor aerobe implică reproducerea lor pe un mediu de agar topit. Prezența unui gaz inert într-o eprubetă face posibilă creșterea coloanelor izolate de bacterii aerobe în așa fel încât culturile aerobe izolate să poată fi văzute clar chiar și cu ochiul liber timp de 2-3 zile.
Micromanipulator
Aceasta este o tehnică pentru izolarea celulelor bacteriene individuale folosind un micromanipulator. Un micromanipulator este un dispozitiv special care poate fi folosit pentru a prinde o celulă dintr-o suspensie și oferă, de asemenea, capacitatea de a inocula cultura într-o eprubetă.
Identificarea ulterioară a agentului patogen se realizează ținând cont de toate proprietățile enumerate ale agentului patogen (aerobi și anaerobi), precum și de caracteristicile interacțiunii lor cu diferite substanțe.
utilizat pe scară largă pentru a determina numărul de microorganisme viabile din sol și alte substraturi naturale. Utilizarea sa permite nu numai să se ia în considerare numărul de microorganisme, ci și să se evalueze diversitatea acestora pe baza morfologiei coloniilor.
Probele de sol se prelevează cu o lingură sterilă, iar studiul se efectuează în ziua în care se prelevează probele. Esența metodei este însămânțarea probei de sol supusă studiului pe un mediu dens în vase Petri și apoi numărarea coloniilor crescute. Se crede că fiecare colonie este rezultatul reproducerii unei celule. Lucrarea se desfășoară în trei etape: pregătirea diluțiilor, însămânțarea în vase și numărarea coloniilor crescute.
Inocularea se face din diluții ale suspensiei, în funcție de numărul așteptat de microorganisme din substratul studiat. Diluțiile se fac în apă sterilă de la robinet sau soluție izotonică de clorură de sodiu. În timpul experimentului, se utilizează un factor de diluție constant. Cel mai adesea, se fac diluții zecimale.
O probă din solul analizat (1-10 g) se pune într-un balon cu 100 ml apă sterilă și se agită. Apoi transferați 1 ml din materialul de testat cu o pipetă sterilă într-o eprubetă cu 9 ml de apă sterilă. Dacă materialul de testat a fost deja diluat de 100 de ori, se obține o diluție de 1:1000. Suspensia acestei diluții este bine amestecată, luând suspensia rezultată într-o pipetă și eliberând-o din aceasta. Apoi, cu aceeași pipetă, se ia 1 ml din diluția rezultată și se transferă într-o a doua eprubetă - se obține o diluție de 1:10000. Diluțiile ulterioare se prepară în același mod. Gradul de diluție este determinat de numărul estimat de microorganisme din probă: cu cât sunt mai multe microorganisme în substratul original, cu atât este mai mare numărul de diluții.
Inocularea se efectuează pe medii de agar în vase Petri. Pentru a determina numărul total de microorganisme, se folosește agar peptonă-carne sau pește-peptonă (MPA, RPA) pentru a determina conținutul de ciuperci din sol, se folosește agarul de must (SA); si microorganisme cu indicatie sanitara se folosesc medii nutritive adecvate. Mediul de agar topit în baie de apă se toarnă în vase Petri sterile, câte 20-30 ml fiecare. Vasele se lasă pe o suprafață orizontală până când agarul se întărește. Folosind o pipetă sterilă, se aplică un anumit volum (de obicei 0,1-0,5 ml) din diluția corespunzătoare, amestecată în prealabil bine, pe suprafața unei plăci de agar într-o cutie Petri. Acest volum este distribuit pe suprafața mediului cu o spatulă sterilă. Apoi această spatulă este trecută pe toată suprafața mediului în a doua și a treia cupă, unde inoculul nu a fost adăugat (metoda de inoculare exhaustivă).
Din fiecare diluție se fac 4-6 însămânțări paralele. Când inoculați aceeași diluție în paralel, puteți utiliza o pipetă sterilă și o spatulă. Cupele cu mediu inoculat se pun într-un termostat reglat la o temperatură favorabilă dezvoltării organismelor depistate. Bacteriile sunt numărate în timpul cultivării la o temperatură de 30 °C după trei zile, la temperatura camerei - după șapte zile. Numărarea drojdiei și ciupercilor - la temperatura camerei după 310 zile (la o temperatură de 25 ° C, perioada de observare a ciupercilor poate fi redusă la 2-3 zile).
Numărul de colonii crescute într-o placă Petri este numărat și recalculat la 1 g. Rezultatele semănărilor paralele sunt însumate și se calculează numărul mediu de colonii crescute la însămânțare din această diluție. Coloniile sunt numărate fără a deschide cutiile Petri.
Precizia metodei depinde de numărul de colonii numărate și nu de numărul de replici. Cea mai bună reproducere este considerată a fi cea care produce de la 50 la 100 de colonii atunci când este însămânțată pe un mediu nutritiv solid. Dacă numărul de colonii crescute este mai mic de 10, atunci aceste rezultate sunt aruncate și nu sunt utilizate pentru a calcula numărul de celule din substratul original. Este de dorit ca numărul total de colonii numărate atunci când sunt semănate dintr-o diluție dată să fie de cel puțin 300.
Numărul de microorganisme din 1 g (1 ml) de substrat original se calculează folosind formula:
T = a x b x c / d,
unde T este numărul de microorganisme în 1 g, a este numărul de colonii numărate, b este diluția din care s-a făcut însămânțarea, c este 10 (dacă s-au semănat 0,1 ml suspensie pe vase), d este masa a substratului (solului) luat pentru analiză
Prelucrarea statistică a rezultatelor este posibilă numai cu o eroare tehnică minimă, astfel încât metoda cupei necesită o curățenie și precizie deosebită atunci când se efectuează toate operațiunile. Este necesar să se protejeze cu atenție pipetele și mediile de contaminare cu microorganisme străine, deoarece o celulă introdusă accidental poate supraestima numărul de microorganisme din suspensia de testare. Pregătirea diluțiilor și a însămânțărilor trebuie făcută într-o cutie.
Metoda descrisă este aplicabilă numărării aerobilor și anaerobilor facultativi. Pentru a ține seama de anaerobii stricti, plăcile Petri sunt plasate în condiții anaerobe după inoculare.
Metode ecologice pentru studiul microorganismelor din sol
Sunt cunoscute relativ puține metode pentru izolarea bacteriilor ca culturi pure. Acest lucru se realizează cel mai adesea prin izolarea celulelor individuale pe un mediu de cultură solid, folosind metoda de placare cu dungi sau prin turnarea unei cantități mici de cultură lichidă în plăci ( metoda de diluare limitatoare). Cu toate acestea, obținerea unei colonii separate nu garantează întotdeauna puritatea culturii, deoarece coloniile pot crește nu numai din celule individuale, ci și din grupurile lor. Dacă microorganismele formează mucus, atunci formele străine sunt adesea atașate de acesta. Pentru purificare, este de preferat să folosiți un mediu neselectiv (NSM), deoarece microorganismele contaminante cresc mai bine pe acesta și sunt mai ușor de detectat.
Obținerea coloniilor izolate pe un mediu nutritiv solid se realizează fie prin cernerea unei suspensii de microorganisme cu o spatulă ( metoda Koch), sau folosind o buclă bacteriologică ( metoda accidentului vascular cerebral de epuizare). Ca urmare a separării mecanice a celulelor microorganismelor, fiecare dintre ele poate da naștere unei colonii izolate de un tip de microb.
Cernerea cu spatula (metoda Koch) produs în următoarea secvență:
1) o picătură de cultură de îmbogățire se aplică pe suprafața mediului nutritiv din vasul nr. 1 cu o pipetă sterilă și se distribuie cu o spatulă sterilă;
2) scoateți spatula, închideți rapid cana și transferați spatula în paharul nr. 2 fără a o steriliza. Simulați distribuția culturii pe întreaga suprafață a mediului atingând suprafața acestuia cu aceeași parte a spatulei care a fost folosită anterior pentru distribuirea probei;
3) exact aceleași acțiuni se efectuează în cana nr. 3, după care spatula este sterilizată;
4) vasele însămânțate se pun într-un termostat și se incubează la temperatura optimă.
După un anumit timp, cupele sunt scoase din termostat și se studiază creșterea microorganismelor. De obicei, în paharul nr. 1 se observă creșterea continuă a bacteriilor, iar coloniile sunt notate în cupele ulterioare.
Cernerea în buclă (metoda cu drenare a dungilor) presupune însămânțarea unei bucle bacteriologice dintr-o cultură de îmbogățire pe suprafața unui mediu de agar în cutii Petri. În prima etapă, se aplică o serie de mișcări paralele pe mediul de agar folosind o buclă cu cultura (Figura 4.2, A). Ansa se sterilizează, se răcește pe partea neinoculată a mediului de agar și se fac o serie de mișcări în direcția perpendiculară pe primele (Figura 4.2, B). Apoi bucla este sterilizată din nou, răcită și se aplică lovituri în direcție ÎN(Figura 4.2), iar după următoarea sterilizare - în direcția G(Figura 4.2). Cupele se pun intr-un termostat si se iau in calcul rezultatele dupa un anumit timp. De obicei pe lovituri AȘi B un număr mare de colonii cresc (uneori creștere continuă), în timp ce pe stroke ÎNȘi G se formează colonii izolate.
Figura 4.2 – Schema de cernere în dungi a bacteriilor pentru a obține colonii izolate
Diluții în serie în medii solide- cea mai simplă metodă de însămânțare a plăcilor, care constă în faptul că după inocularea probei într-o eprubetă cu agar steril topit și răcit, mediul se amestecă, se toarnă într-o cutie Petri și se lasă să se întărească. Pentru a obține colonii bine izolate, se prepară o serie de diluții succesive de zece ori și se adaugă 1 ml de probe direct în cupă, se adaugă 15–20 ml de mediu de agar topit și se amestecă agitând paharul. Uneori, coloniile individuale ajung să fie scufundate în agar și pot fi îndepărtate doar mecanic. De asemenea, este rău că bacteriile petrec ceva timp într-un mediu la temperatura agarului topit.
