O analiză detaliată a mecanismelor moleculare de reglare a replicării ADN-ului depășește scopul cărții, așa că ne vom limita la câteva comentarii pe această problemă și vom discuta mai detaliat doar mecanismul de reglare a replicării la E. coli, inclusiv plasmide bacteriene, care este direct legată de funcționarea vectorilor plasmidii din celulele bacteriene.
Sinteza ADN-ului este strâns legată de alte procese care pregătesc diviziunea celulară, deoarece transferul informațiilor genetice necesare de la celulele părinte la celulele fiice este vital pentru celulele descendente. Prezența excesului de informații genetice afectează negativ viabilitatea celulei, în timp ce deficiența acesteia, rezultată din subreplicarea ADN-ului, duce la un efect letal din cauza absenței genelor vitale. Cu toate acestea, procesul de transfer al informațiilor genetice de la celulele părinte la celulele fiice la eucariote nu se limitează la simpla reduplicare a ADN-ului cromozomilor. Astfel, insectele multor specii se caracterizează prin prezența gigantului politen cromozomi care apar ca urmare a mai multor runde de replicare a ADN-ului cromatidelor originale, neînsoțite de divergența lor.
Politenizare cromozomii reprezintă o clasă mare de fenomene genetice asociate cu suprareplicarea selectivă ( animaţie) sau subreplicarea locilor genetici individuali ai eucariotelor. Un exemplu izbitor de acest fel este o modificare a numărului de gene de ARN ribozomal la animale. Amplificarea genelor ARNr în ovocitele amfibiene are loc prin formarea copiilor lor extracromozomiale (extracromozomiale) sub formă de molecule circulare de ADN ribozomal (r), care sunt replicate în continuare folosind mecanismul „inelului de rulare”. În acest caz, în fiecare celulă este amplificată doar una dintre sutele de repetări ADNr, astfel încât amplificarea ADNr-ului la o repetare suprimă cumva procesul de amplificare pe celelalte, iar toate repetările rezultate ale unui ovocit sunt identice, dar diferă de seturile de amplificare. ADNr al altor ovocite. Specificitatea strictă a stadiului și a țesuturilor, precum și amplificarea selectivă a unei singure repetări ADNr indică și în acest caz prezența unor mecanisme subtile de reglare a procesului de replicare.
Exemple tipice de creștere a numărului de gene datorită replicării lor selective sunt Mărire genele ARNr și modificările numărului de gene care determină rezistența celulelor la medicamente. În primul caz, pierderea unor gene ARNr la Drosophila ca urmare a ștergerii este însoțită de o restabilire treptată a numărului lor, în timp ce în al doilea caz, în celule în condiții de acțiune selectivă a unui medicament care este toxic pentru acestea, numărul de copii ale genelor necesare neutralizării acesteia crește. În special, aceasta este caracteristică genei dihidrofolat reductazei în prezența metotrexatului. Se sugerează că modificarea numărului de copii ale unor astfel de gene se bazează pe mecanismul încrucișării inegale.
Replicarea cromozomilor bacterieni este strâns legată de metabolismul celular. De exemplu, frecvența de inițiere a noilor runde de replicare depinde de rata de creștere a celulelor bacteriene, iar celulele bacteriilor cu creștere rapidă pot conține cromozomi cu mai multe furculițe de replicare funcționale, deși replicarea unui cromozom bacterian necesită doar două, inițiate la o origine unică de replicare (ori) și divergentă în direcții opuse. Acest lucru permite bacteriilor, în condiții favorabile, să petreacă mai puțin timp generând decât pentru replicarea completă a cromozomului bacterian. Este evident că, pentru a menține o natură strict ordonată a replicării, trebuie să existe mecanisme subtile de reglare a replicării la nivelul inițierii unor noi runde. Astfel de mecanisme există de fapt.
Mecanismele cele mai bine studiate în prezent sunt mecanismele de reglare a sintezei ADN-ului la E. coli, inclusiv mecanismele de control al numărului de copii în plasmida mică E. coli ColE1, care vor fi discutate mai jos mai detaliat datorită importanței acestora. fenomene pentru inginerie genetică.
Curs 3. Replicarea diverselor ADN-uri și reglarea și repararea acestuia
Watson și Crick au propus că pentru ca ADN-ul să se dubleze, legăturile de hidrogen care țin împreună duplexul elicoidal trebuie să fie rupte, iar firele trebuie separate. Ei au sugerat, de asemenea, că fiecare catenă a duplexului servește ca șablon pentru sinteza catenei complementare și, ca urmare, se formează două perechi de lanțuri, în fiecare dintre ele doar unul este părintele. Watson și Crick au presupus că replicarea ADN-ului are loc spontan, fără participarea enzimelor, dar acest lucru s-a dovedit a fi incorect. Totuși, ideea că duplicarea ADN-ului are loc prin combinarea nucleotidelor în secvență conform regulii de complementaritate specificată de fiecare catenă a helixului a rezolvat problema conceptuală a reproducerii precise a genelor.
De când a fost făcută această propunere, natura șablon a mecanismului de replicare a fost confirmată de numeroase date obținute atât in vitro, cât și in vivo pentru diferite organisme. Conform modelului, replicarea întregului ADN dublu catenar este semi-conservativă. Dovada mecanismului semi-conservator a fost obținută în 1958 de oamenii de știință Meselson și Steel(em). Mai întâi, au crescut bacterii pentru o lungă perioadă de timp pe un mediu care conține un izotop greu de azot (15 N), care a fost încorporat în ADN, apoi le-au transferat într-un mediu care conține un izotop ușor de azot obișnuit (14 N). După replicare, ADN-ul fiică din prima generație a fost fracționat prin densitate. S-a dovedit că tot ADN-ul fiică este omogen și are o densitate intermediară între densitatea ADN-ului greu și cel ușor. În consecință, o catenă a moleculei de ADN fiică conținea 15 N, iar cealaltă 14 N, ceea ce corespunde unui mecanism semi-conservator. Nu se știe dacă în natură există metode alternative de replicare a ADN-ului dublu catenar (conservativ și dispersat). Deci, după o rundă de replicare, o catenă din fiecare dintre cele două ADN-uri fiice este părintele, adică. conservator, iar celălalt – nou sintetizat.
Replicarea ADN-ului monocatenar în virusuri. Dacă genomul este reprezentat de ADN monocatenar (ca în unele viruși), atunci această singură catenă servește ca șablon pentru formarea unei catene complementare cu care formează un duplex și apoi fie duplexuri fiice, fie copii monocatenar ale unul dintre firele lor șablon sunt sintetizate pe acest duplex. Replicarea materialului genetic al virusului are loc de obicei cu participarea enzimelor celulei gazdă. Pe unele molecule de ADN viral, copiile ADN sunt, de asemenea, sintetizate, folosind fie polimeraza celulară, fie codificată de virus. Aceste copii ADN sunt utilizate ulterior în asamblarea particulelor de virus. Replicarea ADN-ului viral are loc fie în nucleul celulei gazdă (virusul herpes), fie în citoplasmă (poxvirusuri).
Replicarea la procariote. Reduplicarea ADN-ului(procesul prin care informațiile codificate în secvența de bază a moleculei de ADN părinte sunt transmise cu acuratețe maximă către ADN-ul fiică) este realizat de o enzimă specială, ADN polimeraza. Aterizarea acestei enzime pe una dintre catenele de ADN este precedată de o rupere strict localizată a inelului, dacă ADN-ul este circular (în bacterii) și o oarecare desfășurare a secțiunii terminale a helixului său dublu catenar gigant. Să observăm imediat că ADN polimeraza poate ateriza pe oricare dintre cele două capete ale helixului, dar întotdeauna pe catena pentru care acest capăt este capătul de 3" (fie că este vorba de catena „codificatoare” sau „protectoare”). enzima de-a lungul „matricei” catena mamă merge întotdeauna în direcția de la capătul de 3” la capătul de 5” Rezultă că noua catenă de ADN sintetizată folosind această matrice, „complementară” acesteia, va începe cu cea de 5”. sfârșit și crește în direcția viitorului său 3" - capăt. Aceste două direcții nu trebuie confundate. În caz de îndoială, este suficient să ne amintim că creșterea firului nou sintetizat are loc prin adăugare secvențială. nucleotide, purtând deja o grupare fosfat legată de carbonul de 5" al deoxiribozei. În consecință, trebuie adăugat la nucleotida anterioară deja existentă la grupa sa OH legată de carbonul de 3" al deoxiribozei. Și asta înseamnă că creșterea unei noi catene de ADN merge în direcția 5 "-3" . Este oportun să reamintim aici că activitatea de avansare a ADN polimerazei este realizată datorită energiei de rupere a legăturii chimice dintre primul și al doilea fosfat al nucleozidului trifosfat corespunzător - precursorul nucleotidei atașate.
Acum să trecem la completări și clarificări. Să începem cu faptul că nu una, ci trei ADN polimeraze au fost găsite în celula E. coli. Ele diferă semnificativ unele de altele prin greutatea moleculară și prin numărul de molecule din fiecare conținute în celulă. Și, de asemenea, prin rolul lor în procesul de reduplicare a ADN-ului.
Din punct de vedere istoric, primul care a fost descoperit și purificat ADN polimeraza I(enzima Kornberg). Apoi au apărut ADN polimerazele II și III, Greutățile moleculare ale acestor trei enzime sunt, respectiv, 109, 90 și, respectiv, 300 kDa, iar reprezentarea lor într-o celulă este de 300, 40 și 20 de bucăți. Diferența de funcții va fi clară din cele ce urmează.
Începem descrierea primei etape de reduplicare cu faptul că desfășurarea inițială a capătului moleculei de ADN părinte dublu catenar este efectuată folosind o proteină specială. „topoizomeraze”.(transparent 6) la punctul de origine al replicării - ori (origine - începutul replicării).
Structura originilor replicării. Fragmentele de ADN care poartă originea replicării au fost izolate din E. coli și unele plasmide, precum și din drojdie și un număr de virusuri eucariote. În unele cazuri, originea replicării are o astfel de secvență de nucleotide încât duplexul capătă o configurație neobișnuită, care este recunoscută de proteinele implicate în inițiere. Natura interacțiunii dintre originea replicării și proteine și mecanismul de inițiere în general au fost puțin studiate.
Deci, topoizomeraza se deplasează de-a lungul unei molecule dublu catenare, slăbind legăturile sale de hidrogen atât de mult încât în secțiunea terminală scurtă prin care trece, aceste legături sunt rupte deja la o temperatură de 37°C. În urma topoizomerazei, o altă proteină aterizează pe ADN-ul matern și începe să se miște de-a lungul acestuia. ADN helicaza, care își va juca rolul mai târziu. Apoi o ARN polimerază specială care funcționează doar de la capătul catenei de ADN, numită "primaza" formează un lanț foarte scurt de ribonucleotide (numit "grund") complementar cu începutul catenei de ADN. La bacterii, aceasta este doar 5 nucleotide, iar la eucariote este de aproximativ 40. (În Fig. 28, toți primerii sunt prezentați ca o linie subțire, iar toate catenele de ADN sunt prezentate ca o linie îngroșată.)
Abia acum, imediat după primer, ADN polimeraza se așează pe aceeași catenă de ADN (pentru simplitate, să o numim „întâi”), care poate începe construirea unei catene de ADN complementare doar pornind de la primer, unindu-l („dansing from the sobe”); ”). Aceasta este ADN polimeraza III, cea mai mare, constând din 6 subunități și cea principală în funcția sa - va efectua „sinteza complementară” a ADN-ului de-a lungul acestei prime catene de ADN matern până la sfârșit. Mișcarea inițială a acestei ADN polimeraze este limitată la 1-2 mii de nucleotide ale primei catene (la eucariote - doar 200 de nucleotide).
Al doilea fir mamă (încă gol) formează o „furcă de reduplicare” împreună cu primul fir.
Între helicază și ADN polimeraza III, se formează o porțiune din prima catenă expusă. Al 2-lea thread nu este încă acoperit de nimic. Aceste două fire se pot închide din nou după ce helicaza pleacă. Pentru a preveni acest lucru, patru așa-numite „Proteină care leagă ADN”. Nu li se atribuie alte funcții decât protecția împotriva restaurării dublei helix ADN în apropierea vârfului furcii...
După ce a ajuns în vârful furculiței catenelor divergente ale ADN-ului matern, proteinele tandem de legare a helicazei-ADN - ADN polimeraza III se oprește (vezi Fig. 28). Topoizomeraza se deplasează mai departe de-a lungul ADN-ului părinte dublu catenar, iar helicaza rupe legătura zahăr-fosfat de pe a doua catenă. Condensat în zona adiacentă furcii, spirele dublei helix se îndreaptă, prima catenă de ADN, împreună cu proteinele așezate pe ea, se rotește în jurul axei sale, iar bucata tăiată a celei de-a doua catene, asociată temporar cu helicaza, de asemenea, se rotește în jurul acestui fir. Această piesă se numește „fragmentul Okazaki” - după omul de știință care a descoperit aspectul unor astfel de fragmente în timpul reduplicării. Odată ce tensiunea este îndepărtată, firele dublei helix ADN-ului matern pot începe să se separe din nou. Dar înainte de asta, de la capătul tăiat al fragmentului Okazaki, o altă primază începe să construiască un nou primer ribonucleotidic pe ea. Apoi helicaza eliberează fragmentul și se deplasează înainte, și o enzimă specială "ligaza" coase începutul fragmentului Okazaki la locul său inițial - la a 2-a catenă de ADN matern. Rețineți că ligaza (M=96 mii) în celula E.coli este reprezentată de cea mai numeroasă populație - aproximativ 200 de molecule. Din care rezultă că nu efectuează lucrări de „reparație” aleatoare, ci este membru cu drepturi depline al setului de enzime care asigură reduplicarea ADN-ului (asemănător cu importanța firelor pentru un chirurg).
Când primerul este gata, ADN polimeraza I se așează în fața acesteia, spre capătul de 5" al celei de-a 2-a catene mamă a ADN-ului. Începe construcția unei catene complementare acestui fragment al celei de-a 2-a catene, din nou în direcția 3" - 5", numărarea acestei catene, ADN polimeraza I ajunge la capătul fragmentului Okazaki și este îndepărtată. Aceasta încheie etapa I de reduplicare (Fig. 28).
Între timp, primerul rămas la începutul primei catene este distrus de o anumită „ribonuclează H”, o enzimă care rupe catena de ARN complexată cu catena de ADN. În locul său, ADN polimeraza II pune dezoxiribonucleotidele „corecte”. În același timp, topoizomeraza, helicaza și după ele ADN polimeraza III avansează.
Începe a 2-a etapă de reduplicare. Furculița de replicare se mișcă și ea înainte, secțiunea adiacentă a ADN-ului matern dublu catenar devine compactată și întregul tandem de sinteză se oprește. Helicase taie din nou al 2-lea fir, formând un al doilea fragment Okazaki. La fel ca și înainte, un primer este creat la capătul tăiat (temporar) al fragmentului, ADN polimeraza I este „atașată” de acesta și începe să copieze al doilea fragment Okazaki, adică. A doua catenă a ADN-ului matern. Singura diferență în a doua etapă va fi că pe calea acestei polimeraze va întâlni un primer rămas de la copierea primului fragment Okazaki. Dar ADN polimeraza I, spre deosebire de toate celelalte ADN polimeraze, are și activitate exonuclează de 5"-3", adică în direcția mișcării sale. Ea distruge grundul și ajunge la locul unde predecesorul ei a început să copieze primul fragment din Okazaki. Tot ceea ce rămâne este să conectăm aceste două bucăți din lanțul complementar nou sintetizat cu o legătură fosfodiester. Desigur, acest lucru este realizat de ADN-ligaza omniprezentă.
Replicarea ADN-ului
Replicarea ADN-ului- procesul de sinteză a unei molecule fiice de acid dezoxiribonucleic pe matricea moleculei de ADN părinte. În timpul diviziunii ulterioare a celulei mamă, fiecare celulă fiică primește o copie a unei molecule de ADN care este identică cu ADN-ul celulei mamă inițiale. Acest proces asigură transmiterea cu acuratețe a informațiilor genetice din generație în generație. Replicarea ADN-ului este realizată de un complex enzimatic complex format din 15-20 de proteine diferite, numit engleză. replisome) .
Istoria studiului
Fiecare moleculă de ADN constă dintr-o catenă a moleculei părinte inițiale și o catenă nou sintetizată. Acest mecanism de replicare se numește semi-conservator. În prezent, acest mecanism este considerat dovedit datorită experimentelor lui Matthew Meselson și Franklin Stahl (g.). Anterior, existau alte două modele: „conservator” - ca urmare a replicării, se formează o moleculă de ADN, constând numai din lanțuri părinte și una, constând numai din lanțuri fiice; „dispersive” - toate moleculele de ADN rezultate din replicare constau din lanțuri, dintre care unele secțiuni sunt nou sintetizate, în timp ce altele sunt preluate din molecula de ADN părinte.
Vederi generale
Replicarea ADN-ului este un eveniment cheie în timpul diviziunii celulare. Este important ca până la momentul divizării ADN-ul să fi fost replicat complet și o singură dată. Acest lucru este asigurat de anumite mecanisme care reglează replicarea ADN-ului. Replicarea are loc în trei etape:
- iniţierea replicării
- elongaţie
- terminarea replicării.
Reglarea replicării are loc în principal în stadiul de inițiere. Acest lucru este destul de ușor de implementat, deoarece replicarea poate începe nu de la orice secțiune de ADN, ci de la una strict definită, numită situl de inițiere a replicării. Pot exista fie doar unul, fie mai multe astfel de site-uri în genom. Strâns legat de conceptul de site de inițiere a replicării este conceptul replicon . Un replicon este o secțiune a ADN-ului care conține un loc de inițiere al replicării și este replicat după ce sinteza ADN-ului începe de la acest site. Genomul bacterian, de regulă, reprezintă un singur replicon, ceea ce înseamnă că replicarea întregului genom este o consecință a unui singur act de inițiere a replicării. Genomul eucariotic (precum și cromozomii lor individuali) constau dintr-un număr mare de repliconi independenți, ceea ce reduce semnificativ timpul total de replicare al unui cromozom individual. Mecanismele moleculare care controlează numărul de evenimente de inițiere a replicării la fiecare loc în timpul unui ciclu de diviziune celulară sunt numite control al numărului de copii. Pe lângă ADN-ul cromozomial, celulele bacteriene conțin adesea plasmide, care sunt repliconi individuali. Plasmidele au propriile mecanisme de control al numărului de copii: pot asigura sinteza unei singure copii a plasmidei pe ciclu celular sau a mii de copii.
Replicarea începe la locul de inițiere a replicării odată cu desfășurarea dublei helix ADN, care formează furcă de replicare - locul de replicare directă a ADN-ului. Fiecare site poate forma una sau două furcuri de replicare, în funcție de faptul dacă replicarea este unidirecțională sau bidirecțională. Replicarea bidirecțională este mai frecventă. La ceva timp după începerea replicării, se poate observa la microscopul electronic ochi de replicare - o secțiune a unui cromozom în care ADN-ul a fost deja replicat, înconjurat de secțiuni mai lungi de ADN nereplicat.
La bifurcația de replicare, ADN-ul copiază un complex proteic mare (replizom), a cărui enzimă cheie este ADN polimeraza. Furca de replicare se mișcă cu o viteză de aproximativ 100.000 de perechi de baze pe minut la procariote și 500-5000 la eucariote.
Mecanismul molecular de replicare
Enzimele (helicaza, topoizomeraza) și proteinele care leagă ADN-ul desfășoară ADN-ul, mențin șablonul în stare diluată și rotesc molecula de ADN. Replicarea corectă este asigurată de potrivirea exactă a perechilor de baze complementare și de activitatea ADN polimerazei, care este capabilă să recunoască și să corecteze eroarea. Replicarea la eucariote este realizată de mai multe ADN polimeraze diferite. În continuare, moleculele sintetizate sunt răsucite conform principiului supraînfăşurării şi compactării ulterioare a ADN-ului. Sinteza este consumatoare de energie.
Catenele moleculei de ADN diverg, formează o furcă de replicare și fiecare dintre ele devine un șablon pe care este sintetizată o nouă catenă complementară. Ca urmare, se formează două noi molecule de ADN dublu catenar, identice cu molecula părinte.
Caracteristicile procesului de replicare
Note
Literatură
- Conservarea ADN-ului de-a lungul generațiilor: replicarea ADN-ului (Favorova O.O., SOZH, 1996)PDF (151 KB)
- Replicarea ADN (animație) (engleză)
Fundația Wikimedia. 2010.
- Replicant (BeOS)
- Repnikha
Vedeți ce înseamnă „replicarea ADN” în alte dicționare:
replicarea ADN-ului- - biosinteza noului ADN pe matricea ADN-ului matern... Un scurt dicționar de termeni biochimici
Replicarea ADN-ului- DNR biosintezė statusas T sritis chemija apibrėžtis Fermentų katalizuojama polinukleotidinė DNR sintezė și DNR matricos. atitikmenys: engl. Replicarea ADN-ului rus. Replicarea ADN-ului ryšiai: sinonimas – DNR replikacija… Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
REPLICAREA- (din Late Lat. replicatio repetition), reduplicarea, autoreplicarea, procesul de auto-reproducere a macromoleculelor de acid nucleic, asigurarea copierii exacte a geneticii. informaţia şi transmiterea acesteia din generaţie în generaţie. În centrul mecanismului R....... Dicționar enciclopedic biologic
REPLICAREA- (din Late Lat. replicatio repetition) (autoreproducție, autosinteză, reduplicare), dublarea moleculelor de ADN (în unele virusuri ARN) cu participarea unor enzime speciale. Replicarea se mai numește și duplicarea cromozomilor, care se bazează pe replicare... Dicţionar enciclopedic mare
ADN- (acid dezoxiribonucleic), ACID NUCLEIC, care este componenta principală a CROMOZOMILOR celulelor eucariote și a unor VIRUSURI. ADN-ul este adesea numit „materialul de construcție” al vieții, deoarece stochează CODUL GENETIC,... ... Dicționar enciclopedic științific și tehnic
Replicare negestionată- * replicare neîncetată * replicare neîntreruptă replicare multiplă a ADN-ului plasmidic, care nu este asociată cu diviziunea celulară și nu este controlată de această diviziune... Genetica. Dicţionar enciclopedic
ADN- ADN dublu helix Acidul dezoxiribonucleic (ADN) este unul dintre cele două tipuri de acizi nucleici care asigură stocarea, transmiterea din generație în generație și implementarea programului genetic pentru dezvoltarea și funcționarea organismelor vii. Principal... ...Wikipedia
Replicare (biologie)
Replicare (citologie)- Reprezentarea schematică a procesului de replicare, numerele indică: (1) catenă întârziată, (2) catena conducătoare, (3) ADN polimerază (Polα), (4) ADN ligază, (5) Primer ARN, (6) ADN primază, (7 ) Fragment Okazaki, (8) ADN polimerază (Polδ), (9) ... ... Wikipedia
Curs 3. Replicarea diverselor ADN-uri și reglarea și repararea acestuia
Watson și Crick au propus că pentru ca ADN-ul să se dubleze, legăturile de hidrogen care țin împreună duplexul elicoidal trebuie să fie rupte, iar firele trebuie separate. Ei au sugerat, de asemenea, că fiecare catenă a duplexului servește ca șablon pentru sinteza catenei complementare și, ca urmare, se formează două perechi de lanțuri, în fiecare dintre ele doar unul este părintele. Watson și Crick au presupus că replicarea ADN-ului are loc spontan, fără participarea enzimelor, dar acest lucru s-a dovedit a fi incorect. Totuși, ideea că duplicarea ADN-ului are loc prin combinarea nucleotidelor în secvență conform regulii de complementaritate specificată de fiecare catenă a helixului a rezolvat problema conceptuală a reproducerii precise a genelor.
De când a fost făcută această propunere, natura șablon a mecanismului de replicare a fost confirmată de numeroase date obținute atât in vitro, cât și in vivo pentru diferite organisme. Conform modelului, replicarea întregului ADN dublu catenar este semi-conservativă. Dovada mecanismului semi-conservator a fost obținută în 1958 de oamenii de știință Meselson și Steel(em). Mai întâi, au crescut bacterii pentru o lungă perioadă de timp pe un mediu care conține un izotop greu de azot (15 N), care a fost încorporat în ADN, apoi le-au transferat într-un mediu care conține un izotop ușor de azot obișnuit (14 N). După replicare, ADN-ul fiică din prima generație a fost fracționat prin densitate. S-a dovedit că tot ADN-ul fiică este omogen și are o densitate intermediară între densitatea ADN-ului greu și cel ușor. În consecință, o catenă a moleculei de ADN fiică conținea 15 N, iar cealaltă 14 N, ceea ce corespunde unui mecanism semi-conservator. Nu se știe dacă în natură există metode alternative de replicare a ADN-ului dublu catenar (conservativ și dispersat). Deci, după o rundă de replicare, o catenă din fiecare dintre cele două ADN-uri fiice este părintele, adică. conservator, iar celălalt – nou sintetizat.
Replicarea ADN-ului monocatenar în virusuri. Dacă genomul este reprezentat de ADN monocatenar (ca în unele viruși), atunci această singură catenă servește ca șablon pentru formarea unei catene complementare cu care formează un duplex și apoi fie duplexuri fiice, fie copii monocatenar ale unul dintre firele lor șablon sunt sintetizate pe acest duplex. Replicarea materialului genetic al virusului are loc de obicei cu participarea enzimelor celulei gazdă. Pe unele molecule de ADN viral, copiile ADN sunt, de asemenea, sintetizate, folosind fie polimeraza celulară, fie codificată de virus. Aceste copii ADN sunt utilizate ulterior în asamblarea particulelor de virus. Replicarea ADN-ului viral are loc fie în nucleul celulei gazdă (virusul herpes), fie în citoplasmă (poxvirusuri).
Replicarea la procariote. Reduplicarea ADN-ului(procesul prin care informațiile codificate în secvența de bază a moleculei de ADN părinte sunt transmise cu acuratețe maximă către ADN-ul fiică) este realizat de o enzimă specială, ADN polimeraza. Aterizarea acestei enzime pe una dintre catenele de ADN este precedată de o rupere strict localizată a inelului, dacă ADN-ul este circular (în bacterii) și o oarecare desfășurare a secțiunii terminale a helixului său dublu catenar gigant. Să observăm imediat că ADN polimeraza poate ateriza pe oricare dintre cele două capete ale helixului, dar întotdeauna pe catena pentru care acest capăt este capătul de 3" (fie că este vorba de catena „codificatoare” sau „protectoare”). enzima de-a lungul „matricei” catena mamă merge întotdeauna în direcția de la capătul de 3” la capătul de 5” Rezultă că noua catenă de ADN sintetizată folosind această matrice, „complementară” acesteia, va începe cu cea de 5”. sfârșit și crește în direcția viitorului său 3" - capăt. Aceste două direcții nu trebuie confundate. În caz de îndoială, este suficient să ne amintim că creșterea firului nou sintetizat are loc prin adăugare secvențială. nucleotide, purtând deja o grupare fosfat legată de carbonul de 5" al deoxiribozei. În consecință, trebuie adăugat la nucleotida anterioară deja existentă la grupa sa OH legată de carbonul de 3" al deoxiribozei. Și asta înseamnă că creșterea unei noi catene de ADN merge în direcția 5 "-3" . Este oportun să reamintim aici că activitatea de avansare a ADN polimerazei este realizată datorită energiei de rupere a legăturii chimice dintre primul și al doilea fosfat al nucleozidului trifosfat corespunzător - precursorul nucleotidei atașate.
Acum să trecem la completări și clarificări. Să începem cu faptul că nu una, ci trei ADN polimeraze au fost găsite în celula E. coli. Ele diferă semnificativ unele de altele prin greutatea moleculară și prin numărul de molecule din fiecare conținute în celulă. Și, de asemenea, prin rolul lor în procesul de reduplicare a ADN-ului.
Din punct de vedere istoric, primul care a fost descoperit și purificat ADN polimeraza I(enzima Kornberg). Apoi au apărut ADN polimerazele II și III, Greutățile moleculare ale acestor trei enzime sunt, respectiv, 109, 90 și, respectiv, 300 kDa, iar reprezentarea lor într-o celulă este de 300, 40 și 20 de bucăți. Diferența de funcții va fi clară din cele ce urmează.
Începem descrierea primei etape de reduplicare cu faptul că desfășurarea inițială a capătului moleculei de ADN părinte dublu catenar este efectuată folosind o proteină specială. „topoizomeraze”.(transparent 6) la punctul de origine al replicării - ori (origine - începutul replicării).
Structura originilor replicării. Fragmentele de ADN care poartă originea replicării au fost izolate din E. coli și unele plasmide, precum și din drojdie și un număr de virusuri eucariote. În unele cazuri, originea replicării are o astfel de secvență de nucleotide încât duplexul capătă o configurație neobișnuită, care este recunoscută de proteinele implicate în inițiere. Natura interacțiunii dintre originea replicării și proteine și mecanismul de inițiere în general au fost puțin studiate.
Deci, topoizomeraza se deplasează de-a lungul unei molecule dublu catenare, slăbind legăturile sale de hidrogen atât de mult încât în secțiunea terminală scurtă prin care trece, aceste legături sunt rupte deja la o temperatură de 37°C. În urma topoizomerazei, o altă proteină aterizează pe ADN-ul matern și începe să se miște de-a lungul acestuia. ADN helicaza, care își va juca rolul mai târziu. Apoi o ARN polimerază specială care funcționează doar de la capătul catenei de ADN, numită "primaza" formează un lanț foarte scurt de ribonucleotide (numit "grund") complementar cu începutul catenei de ADN. La bacterii, aceasta este doar 5 nucleotide, iar la eucariote este de aproximativ 40. (În Fig. 28, toți primerii sunt prezentați ca o linie subțire, iar toate catenele de ADN sunt prezentate ca o linie îngroșată.)
Abia acum, imediat după primer, ADN polimeraza se așează pe aceeași catenă de ADN (pentru simplitate, să o numim „întâi”), care poate începe construirea unei catene de ADN complementare doar pornind de la primer, unindu-l („dansing from the sobe”); ”). Aceasta este ADN polimeraza III, cea mai mare, constând din 6 subunități și cea principală în funcția sa - va efectua „sinteza complementară” a ADN-ului de-a lungul acestei prime catene de ADN matern până la sfârșit. Mișcarea inițială a acestei ADN polimeraze este limitată la 1-2 mii de nucleotide ale primei catene (la eucariote - doar 200 de nucleotide).
Al doilea fir mamă (încă gol) formează o „furcă de reduplicare” împreună cu primul fir.
Între helicază și ADN polimeraza III, se formează o porțiune din prima catenă expusă. Al 2-lea thread nu este încă acoperit de nimic. Aceste două fire se pot închide din nou după ce helicaza pleacă. Pentru a preveni acest lucru, patru așa-numite „Proteină care leagă ADN”. Nu li se atribuie alte funcții decât protecția împotriva restaurării dublei helix ADN în apropierea vârfului furcii...
După ce a ajuns în vârful furculiței catenelor divergente ale ADN-ului matern, proteinele tandem de legare a helicazei-ADN - ADN polimeraza III se oprește (vezi Fig. 28). Topoizomeraza se deplasează mai departe de-a lungul ADN-ului părinte dublu catenar, iar helicaza rupe legătura zahăr-fosfat de pe a doua catenă. Condensat în zona adiacentă furcii, spirele dublei helix se îndreaptă, prima catenă de ADN, împreună cu proteinele așezate pe ea, se rotește în jurul axei sale, iar bucata tăiată a celei de-a doua catene, asociată temporar cu helicaza, de asemenea, se rotește în jurul acestui fir. Această piesă se numește „fragmentul Okazaki” - după omul de știință care a descoperit aspectul unor astfel de fragmente în timpul reduplicării. Odată ce tensiunea este îndepărtată, firele dublei helix ADN-ului matern pot începe să se separe din nou. Dar înainte de asta, de la capătul tăiat al fragmentului Okazaki, o altă primază începe să construiască un nou primer ribonucleotidic pe ea. Apoi helicaza eliberează fragmentul și se deplasează înainte, și o enzimă specială "ligaza" coase începutul fragmentului Okazaki la locul său inițial - la a 2-a catenă de ADN matern. Rețineți că ligaza (M=96 mii) în celula E.coli este reprezentată de cea mai numeroasă populație - aproximativ 200 de molecule. Din care rezultă că nu efectuează lucrări de „reparație” aleatoare, ci este membru cu drepturi depline al setului de enzime care asigură reduplicarea ADN-ului (asemănător cu importanța firelor pentru un chirurg).
Când primerul este gata, ADN polimeraza I se așează în fața acesteia, spre capătul de 5" al celei de-a 2-a catene mamă a ADN-ului. Începe construcția unei catene complementare acestui fragment al celei de-a 2-a catene, din nou în direcția 3" - 5", numărarea acestei catene, ADN polimeraza I ajunge la capătul fragmentului Okazaki și este îndepărtată. Aceasta încheie etapa I de reduplicare (Fig. 28).
Între timp, primerul rămas la începutul primei catene este distrus de o anumită „ribonuclează H”, o enzimă care rupe catena de ARN complexată cu catena de ADN. În locul său, ADN polimeraza II pune dezoxiribonucleotidele „corecte”. În același timp, topoizomeraza, helicaza și după ele ADN polimeraza III avansează.
Începe a 2-a etapă de reduplicare. Furculița de replicare se mișcă și ea înainte, secțiunea adiacentă a ADN-ului matern dublu catenar devine compactată și întregul tandem de sinteză se oprește. Helicase taie din nou al 2-lea fir, formând un al doilea fragment Okazaki. La fel ca și înainte, un primer este creat la capătul tăiat (temporar) al fragmentului, ADN polimeraza I este „atașată” de acesta și începe să copieze al doilea fragment Okazaki, adică. A doua catenă a ADN-ului matern. Singura diferență în a doua etapă va fi că pe calea acestei polimeraze va întâlni un primer rămas de la copierea primului fragment Okazaki. Dar ADN polimeraza I, spre deosebire de toate celelalte ADN polimeraze, are și activitate exonuclează de 5"-3", adică în direcția mișcării sale. Ea distruge grundul și ajunge la locul unde predecesorul ei a început să copieze primul fragment din Okazaki. Tot ceea ce rămâne este să conectăm aceste două bucăți din lanțul complementar nou sintetizat cu o legătură fosfodiester. Desigur, acest lucru este realizat de ADN-ligaza omniprezentă.
ribonucleaza H
ADN polimeraza II
Între timp, în regiunea în care se formează cel de-al treilea vârf al furcăturii de reduplicare, apar exact aceleași evenimente ca în etapa a 2-a de reduplicare. Rata acestui proces este estimată la aproximativ 1000 de nucleotide pe secundă la bacterii, 100 la animale și 20 la plante.
Este foarte probabil ca, în același timp, procese similare de desfășurare a dublei helix cu formarea fragmentelor Okazaki și construcția complementară de noi catene de ADN să aibă loc și de la capătul opus al ADN-ului matern. Desigur, acolo ADN polimeraza III se mișcă continuu de-a lungul acelei catene de ADN, pe care am numit-o a doua, iar prima catenă este tăiată în fragmente Okazaki. Când cele două mișcări se întâlnesc, două copii fiice ale ADN-ului original sunt gata. (Vor fi „cusuți” împreună prin aceeași ligatură.) Apropo, s-a dovedit că lungimea fragmentelor Okazaki din E. coli (1-2 mii de nucleotide) este semnificativ mai mare decât la eucariote (mai puțin de 200). Nu este lipsit de interes faptul că acest ultim număr coincide cu lungimea ADN-ului din nucleozom (vezi mai jos).
Un model mai complex de mișcare a furcii de replicare implică formarea unui replizom, un complex multienzimatic de un nivel superior de organizare. Acest complex constă dintr-un complex funcțional primemozom-primază, helicază, polimerază III și eventual girază. Un astfel de complex poate asigura alungirea catenei conducătoare și, în același timp, inițierea ARN primerului, precum și completarea ADN-ului în timpul sintezei catenei întârziate. Doi replizomi care lucrează în concert la două furci de replicare care se mișcă în direcții opuse de-a lungul unui cromozom circular ar face acest model și mai elegant.
Replicarea duplexurilor circulare. Replicarea este de asemenea inițiată la originea replicării (ori).
Șuvițele în creștere formează furculițe de replicare care se încrucișează fie în două direcții (sus) fie în una (de jos), în funcție de natura originii replicării.
În unele genomi circulare, fiecare catenă are propria sa origine de replicare (de exemplu, în ADN-ul mitocondrial animal). Sinteza unui lanț începe în punctul ori >R >. Când noul lanț ajunge în punctul ori >D >, începe sinteza unui alt lanț. Sinteza este inițiată prin formarea ARN primerului.
Unii cromozomi inel dublu catenar se replic într-un mod alternativ numit replicarea cercului rulant.În acest caz, ADN-ul circular dublu catenar este tăiat de o enzimă specifică la un loc unic pe un lanț (punctul de pornire al inelului de rulare), iar nucleotidele sunt adăugate la inelul hidroxil 3΄ rezultat folosind polimeraza III; în acest caz, matricea este un circuit închis intact. Astfel, numai firul principal este sintetizat în furcă. Pe măsură ce lanțul se sintetizează, capătul 5΄ al inelului tăiat este deplasat ca un singur lanț. Ca urmare, lungimea lanțului de conducere poate depăși lungimea matricei de 2-5 ori. Această metodă de replicare este utilizată de fagii M13 sau fX174 (genomul lor matur este ADN circular monocatenar) în etapele târzii ale procesului infecțios, după ce ADN-ul infectant este transformat într-o formă circulară dublu catenară. Catenele simple de ADN care se separă continuu produse prin replicarea cercului rulant sunt tăiate la fiecare origine de replicare și închise pentru a forma forme mature care sunt împachetate în particule virale. Fagul λ folosește acest mod de replicare pentru a forma ADN viral liniar dublu catenar. Matricea substratului în acest caz este ADN circular dublu catenar, care a fost replicat după ce ADN-ul viral liniar a fost transformat într-o formă replicativă circulară la începutul infecției.
În ceea ce privește mecanismul de reduplicare la eucariote, deși este mai puțin studiat, aici au fost găsite și caracterizate până la cinci ADN polimeraze, care sunt de obicei desemnate cu litere grecești: α, β, γ, δ și ε. Principala enzimă similară cu ADN polimeraza III în bacterii este ADN polimeraza δ. ADN polimeraza α este responsabilă pentru construirea primerilor (din ribonucleotide). ADN polimeraza β - copiază fragmentele Okazaki și este responsabilă pentru repararea ADN-ului. ADN polimeraza γ realizează sinteza ADN-ului în mitocondrii. Funcția ADN polimerazei ε este încă necunoscută.
Desigur, ADN-ul gigant al organismelor superioare începe reduplicarea nu numai de la capetele moleculei, ci și în multe puncte intermediare. Se crede că în drojdie există aproximativ 300 de astfel de origini de replicare. Acestea sunt separate între ele de 40 de mii de perechi de nucleotide. Există până la 20.000 de puncte de plecare în ADN-ul uman, situate la intervale de 150 de mii de perechi de baze. Aparent, locurile în care ADN polimeraza δ începe să se deruleze și să aterizeze sunt secvențe de perechi de baze A-T legate relativ slab. După inițiere, replicarea continuă în două direcții din fiecare punct până când furcile de replicare ale două origini de replicare adiacente se îmbină. ADN-ul de lungime completă al fiecărui cromozom fiică este obținut prin unirea catenelor mai scurte, inițiate independent, nou sintetizate.
Telomeri și centromeri. Centomerii și telomerii sunt structurile morfologice cele mai clar definite ale cromozomilor (transparență 12). Multă vreme s-a crezut că structura și funcțiile lor sunt asociate cu unele secvențe speciale de ADN. Cu toate acestea, a fost posibil să se identifice doar o astfel de caracteristică la nivel molecular: prezența în regiunea centromerilor și telomerilor. ADN satelit. ADN-ul satelit este repetări lungi în tandem situate în regiunile centromerelor și telomerilor.
Structura centromerilor. La mamifere, centromerii au o structură complexă în formă de disc numită cinetocor. Există câte un disc cinetocor pe fiecare parte a cromozomului. În timpul mitozei, microtubulii fibrilelor fusului se atașează direct la stratul exterior dens al kinetocorului, asociat cu buclele de cromatină. Kinetocorele din drojdie formează regiuni CEN (segmente scurte de ADN) împreună cu proteinele care leagă ADN-ul (transparente 13). Secvențele situate pe una sau pe ambele părți ale regiunilor CEN pot bloca trecerea furcăturii de replicare până când apare un semnal specific care permite replicării să se termine în anafază. În acest caz, numărul de cromozomi nu va depăși unul pe celulă fiică.
Secvențe în regiunea telomerilor. Telomerele, capetele unui cromozom eucariot, sunt, de asemenea, capetele unui duplex liniar de ADN. Una dintre problemele de replicare este asociată cu telomerii: cum sunt terminate capetele 5΄ ale unui duplex cromozomial dacă ADN-polimerazele nu inițiază sinteza de noi lanțuri? Poate că această problemă este rezolvată în același mod ca în timpul replicării unui duplex liniar de adenovirusuri sau folosind mecanisme alternative? Dovezi recente sugerează că regiunile terminale ale cromozomilor eucarioți - telomerii - se reproduc printr-un mecanism special. Capetele cromozomilor drojdiei, nevertebratelor, plantelor și vertebratelor au o structură similară: ele conțin structuri asemănătoare acelor de păr în care capetele 3΄ și 5΄ ale duplexului ADN sunt adiacente și multe repetări în tandem. Există mai multe întreruperi dintr-un singur fir în apropierea unei bucle într-una dintre firele din regiunea repetă. Recent din Tetrahimena a fost izolată o enzimă - telomeraza - deoxinucleotidil transferaza terminală, care atașează repetarea 5΄-TTGGGG-3΄, secvenţial câte o nucleotidă, la capetele 3΄ ale primerilor oligonucleotidici specifici (TTGGGG) > n > ( Tetrahimena) și (TGTGTGGG) >n > (drojdie). Astfel, telomeraza poate construi telomeri fără a utiliza ADN-ul parental ca șablon (transparent 20). Telomeraza este un complex ribonucleoproteic mare, iar activitatea sa enzimatică necesită atât ARN, cât și proteine. O diagramă ipotetică a formării telomerilor este prezentată în figură. Partea superioară a figurii arată formarea unei bucle la capătul lanțului care conține secvența 5΄-(TTGGGG) >n >-3΄, și rupturi monocatenare pe catena opusă care conține secvența 5΄-( CCCCAA) >n >-3΄. La capătul 3A al lanțului inferior, unități 5A-TTGGGG-3A sunt adăugate secvenţial, câte o nucleotidă, folosind teloizomeraza. Primaza și ADN polimeraza copiază catena 5΄-(TTGGGG) > n > -3΄ pentru a forma noi unități 5΄-(CCCCAA) > n > -3΄. Ca urmare a ligaturii incomplete, rupturile cu o singură catenă rămân în catena bogată în C. La capătul 3΄ al lanțului 5΄-(TTGGGG) >n >-3΄, se formează din nou o buclă, stabilizată prin interacțiuni între reziduurile de guanozină.
Încetarea replicării.
Terminare și divergență în genomi circulari. Structura închisă a multor ADN genomic simplifică procesul de completare a replicării întregii secvențe de nucleotide. Creșterea continuă a catenei conducătoare și întârziate de-a lungul șablonului circular duce inevitabil la alinierea capetelor 3΄-hidroxi și 5΄-fosforil ale unui lanț fie la originea replicării, fie, în replicarea bidirecțională, în mijlocul inelului. (transparent 14). Inelele de la aceste puncte de întâlnire sunt conectate prin ADN ligază și, de obicei, ajung să fie legate în perechi și, ulterior, trebuie separate în genomi separate. Acest lucru are loc prin topoizomeraza de tip II (transparent 15).
Terminare și divergență în ADN-ul liniar. Cu excepția ADN-ului adenoviral, unde sinteza catenelor de ADN este inițiată de un primer proteic și catena șablon este copiată în întregime (transparent 16), în toate celelalte cazuri este necesar un primer ARN pentru replicare, ceea ce creează probleme speciale atunci când completând replicarea ADN-ului duplex liniar (transparent 17). Faptul este că, după inițierea sintezei unui nou lanț și îndepărtarea ulterioară a primerului ARN, lanțul nou sintetizat conține un gol la capătul 5΄. Deoarece nu există nicio modalitate de a extinde capetele 5΄ ale catenelor de ADN, sunt necesare alte metode de completare a replicării. Au fost sugerate doua feluri.
Primul: sugerează că există fire de ADN cu repetări directe la capete (Clear 18). După replicare, cele două capete complementare ale ambelor duplexuri incomplete se pot împerechea și forma concatemeri liniari cu rupturi cu un singur catenar. unind direct capetele de andocare cu ADN ligaze cu formarea de concatemeri. După tăierea concatemerului cu o endonuclează specifică, se formează capete 5΄ în suprafață, iar ADN polimeraza poate extinde lanțuri mai scurte de la capătul 3΄.
Al doilea. Presupune prezența unor scurte repetări inversate la sfârșitul fiecărei catene de ADN, datorită cărora se formează bucle mici (transparente 19). Capătul 3΄ al buclei servește ca primer pentru copierea regiunii nereplicate. Datorită unei întreruperi specifice la începutul repetății inversate, se obține o structură care poate fi completată de la capătul 3΄ pentru a restabili secvența terminală dublu catenară inițială.
Să remarcăm, de asemenea, că toate ADN polimerazele care efectuează sinteza complementară, atât în bacterii, cât și în eucariote, au, de asemenea, activitate exonuclează în direcția 3"-5", direcția opusă sintezei. Ei sunt capabili să se „întoarcă” și să elimine nucleotida pe care tocmai au atașat-o. Acesta este un mecanism foarte important pentru eliminarea erorilor în sinteza complementară. La urma urmei, o greșeală poate fi descoperită doar atunci când a fost deja făcută. Și remediați imediat! ADN-polimerazele „pot” face acest lucru. O astfel de corectare nu este neobișnuită, dar este norma. Se crede că fără ea, în timpul reduplicării ADN din E. coli, 5-10% din nucleotide ar fi atașate incorect. Datorită corecției, există 1 eroare în acest ADN la zece milioane de perechi de baze.
Repararea ADN-ului
ADN-ul este singura macromoleculă celulară care este capabilă să elimine (repara) daunele care au loc în structura sa. Mai mult, codifică informații despre mecanismele unei game largi de procese de reparare. Împerecherea complementară stă la baza nu numai replicării ADN-ului, ci și procesului de restabilire a structurii originale ADN-ului în timpul reparării daunelor care afectează coloana vertebrală a moleculei, modificării unei anumite baze sau împerecherii greșite în timpul recombinării (vezi mai jos). Deteriorarea simultană a ambelor catene într-un singur loc și rupturile dublelor sunt adesea letale pentru ADN, deoarece astfel de defecte sunt reparate numai în cazuri rare.
Cel mai adesea, legăturile glicozidice dintre purină și deoxiriboză N sunt rupte (depurinarea) odată cu creșterea temperaturii. În fiecare zi, într-o celulă umană au loc între 5.000 și 10.000 de acte de depurinare - acest lucru duce la întreruperea replicării și exprimării genelor. În plus, resturile C și A pot suferi dezaminare spontană pentru a forma resturi Y și respectiv hipoxantină; frecvența unor astfel de evenimente este de aproximativ 100 pe genom - acest lucru duce la apariția mutațiilor.
Multe modificări ale structurii ADN-ului apar sub influența substanțelor chimice prezente în mediu. Aceștia sunt agenți de alchilare (compuși azotați, alchil sulfonați, nitrozouree), care modifică preferabil reziduurile G, compuși care se introduc între perechile de baze adiacente și duc la apariția de inserții și deleții în timpul replicării; agenți bifuncționali capabili să formeze legături încrucișate covalente între două catene de ADN și să blocheze divergența acestora în timpul replicării. Efectele fizice nu sunt mai puțin distructive - absorbția luminii UV T sau C duce la formarea de dimeri de ciclobutan între pirimidinele vecine; radiațiile ionizante (razele cosmice) favorizează formarea de radicali liberi foarte reactivi, care au o mare varietate de efecte asupra ADN-ului; Razele X provoacă rupturi simple și duble ale ADN-ului, precum și alte daune caracteristice radicalilor liberi.
Există două metode principale de procese de reparare:
corectarea directă a modificărilor sau nepotrivirilor fără a necesita replicare pentru a restabili structura originală;
îndepărtarea nucleotidelor din jurul perechilor de baze nepotrivite sau modificate și resinteza acestei regiuni prin replicare.
repararea prin restaurare directă a structurii originale.
Dacă, sub influența agenților de alchilare - N-metil-N-nitrozouree sau N 1, N-dimetilnitrozoguanidină, O 6 - metil- sau O 6 -alchil-substituit reziduuri de guanină se formează în ADN, atunci dealchilarea acestor resturi are loc cu participarea enzimelor - O 6 -metilguanină -ADN alchiltransferaza, care catalizează transferul grupărilor alchil la grupările sulfhidril ale reziduurilor de cisteină ale enzimei, în timp ce proteina acceptor este inactivată. Aceasta se întâmplă la bacterii și mamifere.
Dacă, la iradierea ADN-ului cu lumină UV, se formează dimeri de ciclobutan între perechile adiacente de baze pirimidinice, atunci aceștia sunt transformați enzimatic (fotoliazele nu sunt prezente la mamifere) în monomeri atunci când soluția este iluminată cu lumină vizibilă în intervalul de lungimi de undă de 300 -600 nm. Enzima formează un complex stabil cu dimerul de pirimidină și, folosind energia luminii absorbită de acesta, distruge dimerul fără a rupe firele de ADN.
Repararea prin înlocuirea reziduurilor modificate.
Înlocuirea unei nucleotide modificate are loc de obicei în patru etape:
Etapa 1. Enzima recunoaște această nucleotidă și taie lanțul de polinucleotide din apropierea ei sau rupe legătura glicozidică dintre baza modificată și dezoxiriboză. Scindarea situsurilor în care a avut loc depurinizarea sau depirimidinizarea este efectuată de endonucleaze AP (apurinice, apirimidinice). În repararea purinelor N-alchilate și a altor baze modificate, un rol cheie îl joacă enzimele - N-glicozilaze, care scindează legătura glicozidică dintre baza modificată și desoskiriboză (transparență 25)
Etapa 2. Exonucleaza îndepărtează nucleotidele modificate și/sau nucleotidele învecinate, lăsând un mic gol.
Etapa 3. Regiunea ștearsă este sintetizată din nou de la capătul 3A-OH-terminal folosind catena opusă ca șablon.
Etapa 4. Capetele ruperii formate ca urmare a reparației sunt conectate pentru a restabili integritatea covalentă a lanțului reparat (transparent 26)
Importanța reparării ADN-ului.
Eliminarea erorilor de replicare este importantă, deoarece majoritatea daunelor blochează transferul informațiilor genetice către generația următoare, iar restul, dacă nu este eliminat, va rămâne în genomul descendenților și va duce la schimbări dramatice în moleculele de proteine și enzime. necesare pentru menținerea vieții celulei. Atunci când anumite părți ale sistemului de reparare sunt deteriorate, celulele devin deosebit de vulnerabile la anumiți agenți chimici și fizici. Persoanele care suferă de xeroderma pigmentosum, de exemplu, sunt foarte sensibile la lumina UV și dezvoltă diferite forme de cancer de piele chiar și cu foarte puțină expunere la lumina soarelui. Celulele unor astfel de oameni poartă o mutație în genele RAD, care se manifestă prin faptul că au o capacitate afectată de a scinda dimerii de pirimidină din ADN-ul iradiat cu UV. Boala poate fi cauzată de o mutație a uneia dintre cel puțin nouă gene, ceea ce sugerează un mecanism destul de complex de reparare a ADN-ului care conține dimeri de timină la oameni. De obicei, boala este asociată cu incapacitatea de a elimina dimerii de timină. Dacă la celulele iradiate în cultură se adaugă o enzimă cu glicozilază dimer de timină și activități endonucleazei AP, atunci daunele UV pot fi eliminate.
Replicarea are loc după ce celula trece de punctul de restricție sau START
Replicarea este reglată în etape și coordonată cu debutul mitozei
Replicarea are loc la punctele de inițiere, care pot avea o structură primară specială, o poziție specifică sau pot fi situate la anumite distanțe în ADN
Inițierea are loc numai în punctele permise capabile de replicare
După ce și-au îndeplinit funcțiile, punctele de origine de replicare nu pot fi reutilizate până la următorul ciclu.
Când celule au analizat starea mediului și au decis să intre în ciclul de diviziune, trec de punctul G1/S și încep replicarea ADN-ului. Cum se combină și activează celulele factorii necesari pentru replicarea ADN-ului? Ce mecanisme de control asigură că o celulă reproduce ADN-ul o singură dată și o singură dată într-un ciclu?
Deși nu este încă posibil să oferim răspunsuri complete la acestea întrebări, prin identificarea și analiza secvențelor de ADN cromozomial de drojdie capabile de replicare independentă, s-au obținut multe informații despre procesul de replicare a ADN-ului în sine. Aceste secvențe din cromozom, numite secvențe de replicare autonomă (ARS), fac parte din originile replicării. . Punctul de inițiere sau origine (originea replicării) este regiunea secvenței ADN unde începe replicarea.
În drojdia în devenire, dar nu în majoritatea alte organisme, originile replicării sunt reprezentate de mici secvențe de consens. La fuziunea drojdiei, aceste puncte ocupă regiuni mari de ADN bogate în perechi AD, dar nu diferă în nicio structură specială. La alte eucariote, originile de replicare sunt localizate aleatoriu, în conformitate cu distribuția proteinelor asociate nespecific cu ADN-ul în întregul genom.
Pentru a garanta oportunitatea duplicarea genomului, trebuie să existe un număr suficient de origini de replicare pe cromozom. În bacterii, este necesară o singură origine pentru replicarea unui singur cromozom circular, dar la eucariote, care au un genom mare distribuit pe mulți cromozomi liniari, trebuie să existe mai multe origini de replicare. În drojdia în devenire, a cărei dimensiune a genomului este de aproximativ 13 Mb, există aproximativ 400 de origini de replicare pe 16 cromozomi.
Acest lucru creează mai multe probleme legate de reglarea procesului de replicare. Funcționarea originilor de replicare trebuie să fie coordonată cu ciclul celular, astfel încât replicarea să înceapă numai în timpul fazei S. Trebuie să existe o încredere completă că replicarea sa încheiat înainte ca celula să intre în mitoză. Fiecare origine de replicare trebuie să funcționeze o singură dată pentru a se asigura că ADN-ul este replicat o singură dată pe ciclu.
De-a lungul ciclului celular, 0RC este asociat cu originea replicării pe cromozom.Într-o perioadă scurtă de timp, de la mitoza târzie până la G1, proteinele care activează replicarea se leagă și de origine,
Cdc6 și Cdt1, care la rândul lor activează complexul hexameric MCM helicază (MCM2-7).
Acest pas finalizează îndepărtarea blocului de replicare și asamblarea pre-RC.
Puncte de plecare replicare leagă factorii necesari pentru a activa replicarea și a iniția sinteza ADN-ului. Inițierea replicării ADN-ului are loc numai în acele puncte care conțin factori legați și care sunt, prin urmare, clasificate ca puncte permise. Cu toate acestea, fiecare rundă de replicare a ADN-ului implică un set limitat de puncte de plecare potențiale prezente pe cromozomi. Mai mult, deoarece diferite puncte de pornire activate sunt activate la momente diferite, evenimentele de inițiere apar și la intervale de timp diferite. De exemplu, unele puncte sunt activate în faza S timpurie, în timp ce altele intră în această stare mai târziu.
Nu se știe ce stabilește acest lucru factorul timp, dar se pare că localizarea unei origini specifice de replicare pe cromozom determină momentul declanșării acesteia.
Pentru ca replicarea să înceapă, a complex pre-replicativ(pre-RC). Ca rezultat al studiilor genetice în drojdie și experimente biochimice pe extracte de ouă de Xenopus, a fost dezvăluită imaginea asamblarii pre-RC. Procesul începe cu legarea unui complex de șase proteine la ADN, care se numește complex de recunoaștere a originii (ORC). Acest complex marchează originea potențială a replicării, dar nu este suficient pentru activare. Acesta servește ca platformă pentru legarea a două proteine mai conservate: Cdc6, care aparține familiei AAA+ATPaze și Cdt1. (Multe proteine care au un domeniu ATPază utilizează energia ATP pentru a-și face munca.)
Apoi li se alătură complexul suportul minicromozomilor(complex de întreținere a minicromozomilor, MCM), care este o structură ineală constând din șase proteine înrudite, care aparțin, de asemenea, familiei mari de AAA+ATPaze. Complexele MSM sunt prezente în exces și se răspândesc dincolo de originea replicării. Odată ce MCM este atașat, ORC și Cdc6 devin componente dispensabile, iar pre-RC intră într-o stare capabilă de activare. Ordinea evenimentelor care au loc în timpul asamblarii pre-RC la originile replicării este reprezentată schematic în figura de mai jos.
Asamblare pre-RC limitat de intervalul dintre sfârșitul fazei M și faza S timpurie, ceea ce se explică prin următoarele motive. În primul rând, în celulă nivelul proteinei Cdc6 este controlat astfel încât să fie prezent numai în această perioadă de timp. În absența proteinei Cdc6, proteina MSM nu se leagă de originea replicării. În al doilea rând, la metazoare, proteina Cdt1 este reglată negativ de o altă proteină, geminina, care îi blochează activitatea în toate perioadele, cu excepția ferestrei din G1. În cele din urmă, ansamblul pre-RC în sine este limitat de activitatea complexului mitotic CDK-ciclină.
Substraturile acestui complex sunt subunitățile ORC, Cdc6Și MSM. La fosforilare, Cdc6 este inactivat, iar fosforilarea proteinei MSM în faza S determină scindarea acesteia din ADN. Prin urmare, pre-RC se poate forma numai atunci când activitatea complexului CDK-ciclină este scăzută. Aceasta este caracteristică intervalului dintre nivelurile de activitate ridicată a complexului mitotic CDK-ciclină în faza M și în faza S, când crește din nou, promovând activarea originii replicării.
Cât punct începe replicarea trecerea de la starea pre-replicativă la cea replicativă? Această tranziție necesită formarea multor complexe proteice suplimentare, iar procesul este sub controlul a două kinaze, complexul CDK-ciclină și Cdc7-Dbf4 (DDK). Astfel, activitatea complexului CDK-ciclină coordonează procesele de replicare și ciclul celular. În acest caz, coordonarea poate fi atât negativă (prevenirea asamblarii pre-RC și, astfel, refuncționarea originilor de replicare), cât și pozitivă (promovarea activării originilor de replicare). Printre întrebările care așteaptă răspunsuri se numără întrebarea referitoare la substraturile kinazelor care promovează inițierea replicării.
Dacă complexe CDK-ciclină asigura coordonarea proceselor pe tot parcursul ciclului, apoi DDK actioneaza la nivelul punctelor individuale care initiaza sinteza ADN-ului. Cele mai cunoscute substraturi ale acestei kinaze includ proteinele MSM în sine. Interesant este că o mutație punctuală a genei Mcm5 elimină cerința pentru prezența DDK. Acest lucru sugerează că fosforilarea duce la o modificare a structurii proteinei MSM, care determină inițierea replicării. Cu toate acestea, datele disponibile indică faptul că aceste modificări sunt extrem de minore. Sunt prezentate procesele de control ale replicării ADN care implică CDK și DDK.
Probabil procesul de inițiere limitativ replicare la puncte de plecare separate este legarea proteinei Cdc45, care necesită atât complexul CDK-ciclină, cât și DDK. Legarea acestei proteine, care este însoțită de formarea unui complex suplimentar numit GINS, duce la derularea helixului ADN la punctul de plecare, datorită activării complexului MSM, care acționează ca o helicază. Astfel, MSM este convertit dintr-un factor de asamblare implicat în formarea pre-RC într-o enzimă helicază care face parte din complexul de alungire. Desfacerea dublei helix ADN la originea replicării duce la formarea ADN-ului monocatenar, care leagă o proteină RPA specifică, care aparține grupului de proteine care se leagă de ADN-ul monocatenar (proteine de legare a ADNss).
La randul lui, proteina RPA promovează legarea complexului primază/ADN polimerază alfa, care inițiază sinteza ADN-ului. Complexul MSM și Cdc45 se mișcă de-a lungul ADN-ului pentru a forma o furcă de replicare în expansiune, care formează un replizom mare care cuprinde în principal ADN polimeraza 6, mai degrabă decât polimeraza a. Procesele de inițiere a replicării ADN-ului sunt prezentate în figura de mai jos. Punctele de control și sistemele de reparare a ADN-ului sunt implicate în menținerea funcționării replizomului și în protejarea ADN-ului din regiunea furcii de replicare împotriva deteriorării.
De îndată ce MSMîndepărtat de originea replicării, este considerat „utilizat” și nu poate fi reactivat până la sfârșitul următoarei faze M, până când pre-RC se formează din nou la origine. Pe măsură ce faza S progresează, MSM sunt îndepărtați din cromatină. Odată cu aceasta, în timpul mișcării furcii de replicare, se stabilesc legături care leagă cromatidele surori nou formate între ele înainte de debutul mitozei. Astfel, finalizarea fazei S este asociată cu formarea structurilor necesare pentru segregarea corectă a cromozomilor în mitoză, ceea ce indică formarea conexiunilor între diferitele faze ale ciclului celular.
Funcția originilor de replicare este, de asemenea, reglementată la nivelul întreg cromozomii. Este indicat să reamintim că într-o celulă, cu ajutorul nucleozomilor, aceasta este ambalată în cromatină, ceea ce îi impune o serie de restricții structurale. Această împrejurare poate influența organizarea temporală a replicării; de exemplu, nu toate originile în replicarea în faza S au loc în același timp. În unele cazuri, momentul relativ al activării originilor replicării poate fi determinat nu de punctul în sine, ci de locația sa pe cromozom. Punctele situate aproape de eucromatina activă din punct de vedere transcripțional inițiază mai devreme decât cele situate lângă heterocromatina inactivă din punct de vedere transcripțional, care inițiază de obicei în faza S târzie.
