Из чего состоят ферменты. Ферменты. Графически конкурентное ингибирование имеет вид

Давно выяснено, что все ферменты являются белками и обладают всеми свойствами белков. Поэтому подобно белкам ферменты делятся на простые и сложные.

Простые ферменты состоят только из аминокислот – например, пепсин , трипсин , лизоцим .

Сложные ферменты (холоферменты ) имеют в своем составе белковую часть, состоящую из аминокислот – апофермент , и небелковую часть – кофактор . Примером сложных ферментов являются сукцинатдегидрогеназа (содержит ФАД), аминотрансферазы (содержат пиридоксальфосфат), различные пероксидазы (содержат гем), лактатдегидрогеназа (содержит Zn 2+), амилаза (содержит Ca2+ ).

Кофактор , в свою очередь, может называться коферментом (НАД+ , НАДФ+ , ФМН, ФАД, биотин) или простетической группой (гем, олигосахариды, ионы металлов Fe2+ , Mg2+ , Ca2+ , Zn2+ ).

Деление на коферменты и простетические группы не всегда однозначно:
если связь кофактора с белком прочная, то в этом случае говорят о наличии простетической группы ,
но если в качестве кофактора выступает производное витамина – то его называют коферментом , независимо от прочности связи.

Для осуществления катализа необходим полноценный комплекс апобелка и кофактора, по отдельности катализ они осуществить не могут. Кофактор входит в состав активного центра, участвует в связывании субстрата или в его превращении.

Как многие белки, ферменты могут быть мономерами , т.е. состоять из одной субъединицы, и полимерами , состоящими из нескольких субъединиц.

Структурно-функциональная организация ферментов

В составе фермента выделяют области, выполняющие различную функцию:

1. Активный центр – комбинация аминокислотных остатков (обычно 12-16), обеспечивающая непосредственное связывание с молекулой субстрата и осуществляющая катализ. Аминокислотные радикалы в активном центре могут находиться в любом сочетании, при этом рядом располагаются аминокислоты, значительно удаленные друг от друга в линейной цепи. В активном центре выделяют два участка:

якорный (контактный, связывающий) – отвечает за связывание и ориентацию субстрата в активном центре,
каталитический – непосредственно отвечает за осуществление реакции.

Схема строения ферментов

У ферментов, имеющих в своем составе несколько мономеров, может быть несколько активных центров по числу субъединиц. Также две и более субъединицы могут формировать один активный центр.

У сложных ферментов в активном центре обязательно расположены функциональные группы кофактора.

Схема формирования сложного фермента

2. Аллостерический центр (allos – чужой) – центр регуляции активности фермента, который пространственно отделен от активного центра и имеется не у всех ферментов. Связывание с аллостерическим центром какой-либо молекулы (называемой активатором или ингибитором, а также эффектором, модулятором, регулятором) вызывает изменение конфигурации белка-фермента и, как следствие, скорости ферментативной реакции.

Аллостерические ферменты являются полимерными белками, активный и регуляторный центры находятся в разных субъединицах.

Схема строения аллостерического фермента

В качестве такого регулятора может выступать продукт данной или одной из последующих реакций, субстрат реакции или иное вещество (см "Регуляция активности ферментов ").

Изоферменты

Изоферменты – это молекулярные формы одного и того же фермента, возникшие в результате небольших генетических различий в первичной структуре фермента, но катализирующие одну и ту же реакцию . Изоферменты отличаются сродством к субстрату, максимальной скоростью катализируемой реакции, чувствительностью к ингибиторам и активаторам, условиями работы (оптимум pH и температуры).

Как правило, изоферменты имеют четвертичную структуру, т.е. состоят из двух или более субъединиц. Например, димерный фермент креатинкиназа (КК) представлен тремя изоферментными формами, составленными из двух типов субъединиц: M (англ. muscle – мышца) и B (англ. brain – мозг). Креатинкиназа-1 (КК-1) состоит из субъединиц типа B и локализуется в головном мозге, креатинкиназа-2 (КК-2) – по одной М- и В-субъединице, активна в миокарде, креатинкиназа-3 (КК-3) содержит две М-субъединицы, специфична для скелетной мышцы. Определение активности разных изоферментов КК в сыворотке крови имеет .

Также существует пять изоферментов лактатдегидрогеназы (роль ЛДГ) – фермента, участвующего в обмене глюкозы. Отличия между ними заключаются в разном соотношении субъединиц Н (англ. heart – сердце) и М (англ. muscle – мышца). Лактатдегидрогеназы типов 1 (Н 4) и 2 (H 3 M 1) присутствуют в тканях с аэробным обменом (миокард, мозг, корковый слой почек), обладают высоким сродством к молочной кислоте (лактату) и превращают его в пируват. ЛДГ-4 (H 1 M 3) и ЛДГ-5 (М 4) находятся в тканях, склонных к анаэробному обмену (печень, скелетные мышцы, кожа, мозговой слой почек), обладают низким сродством к лактату и катализируют превращение пирувата в лактат. В тканях с промежуточным типом обмена (селезенка, поджелудочная железа, надпочечники, лимфатические узлы) преобладает ЛДГ-3 (H 2 M 2). Определение активности разных изоферментов ЛДГ в сыворотке крови имеет клинико-диагностическое значение .

Еще одним примером изоферментов является группа гексокиназ , которые присоединяют фосфатную группу к моносахаридам гексозам и вовлекают их в реакции клеточного метаболизма. Из четырех изоферментов выделяется гексокиназа IV (глюкокиназа ), которая отличается от остальных изоферментов высокой специфичностью к глюкозе, низким сродством к ней и нечувствительностью к ингибированию продуктом реакции.

органические вещества белковой природы, которые синтезируются в клетках и во много раз ускоряют протекающие в них реакции, не подвергаясь при этом химическим превращениям. Вещества, оказывающие подобное действие, существуют и в неживой природе и называются катализаторами. Ферменты (от лат. fermentum - брожение, закваска) иногда называют энзимами (от греч. en - внутри, zyme - закваска). Все живые клетки содержат очень большой набор ферментов, от каталитической активности которых зависит функционирование клеток. Практически каждая из множества разнообразных реакций, протекающих в клетке, требует участия специфического фермента. Изучением химических свойств ферментов и катализируемых ими реакций занимается особая, очень важная область биохимии - энзимология.

Многие ферменты находятся в клетке в свободном состоянии, будучи просто растворены в цитоплазме; другие связаны со сложными высокоорганизованными структурами. Есть и ферменты, в норме находящиеся вне клетки; так, ферменты, катализирующие расщепление крахмала и белков, секретируются поджелудочной железой в кишечник. Секретируют ферменты и многие микроорганизмы.

Первые данные о ферментах были получены при изучении процессов брожения и пищеварения. Большой вклад в исследование брожения внес Л.Пастер, однако он полагал, что соответствующие реакции могут осуществлять только живые клетки. В начале 20 в. Э.Бухнер показал, что сбраживание сахарозы с образованием диоксида углерода и этилового спирта может катализироваться бесклеточным дрожжевым экстрактом. Это важное открытие послужило стимулом к выделению и изучению клеточных ферментов. В 1926 Дж.Самнер из Корнеллского университета (США) выделил уреазу; это был первый фермент, полученный в практически чистом виде. С тех пор обнаружено и выделено более 700 ферментов, но в живых организмах их существует гораздо больше. Идентификация, выделение и изучение свойств отдельных ферментов занимают центральное место в современной энзимологии.

Ферменты, участвующие в фундаментальных процессах превращения энергии, таких, как расщепление сахаров, образование и гидролиз высокоэнергетического соединения аденозинтрифосфата (АТФ), присутствуют в клетках всех типов - животных, растительных, бактериальных. Однако есть ферменты, которые образуются только в тканях определенных организмов. Так, ферменты, участвующие в синтезе целлюлозы, обнаруживаются в растительных, но не в животных клетках. Таким образом, важно различать «универсальные» ферменты и ферменты, специфичные для тех или иных типов клеток. Вообще говоря, чем более клетка специализирована, тем больше вероятность, что она будет синтезировать набор ферментов, необходимый для выполнения конкретной клеточной функции.

Ферменты и пищеварение . Ферменты - необходимые участники процесса пищеварения. Только низкомолекулярные соединения могут проходить через стенку кишечника и попадать в кровоток, поэтому компоненты пищи должны быть предварительно расщеплены до небольших молекул. Это происходит в ходе ферментативного гидролиза (расщепления) белков до аминокислот, крахмала до сахаров, жиров до жирных кислот и глицерина. Гидролиз белков катализирует фермент пепсин, содержащийся в желудке. Ряд высокоэффективных пищеварительных ферментов секретирует в кишечник поджелудочная железа. Это трипсин и химотрипсин, гидролизующие белки; липаза, расщепляющая жиры; амилаза, катализирующая расщепление крахмала. Пепсин, трипсин и химотрипсин секретируются в неактивной форме, в виде т.н. зимогенов (проферментов), и переходят в активное состояние только в желудке и кишечнике. Это объясняет, почему указанные ферменты не разрушают клетки поджелудочной железы и желудка. Стенки желудка и кишечника защищает от пищеварительных ферментов и слой слизи. Некоторые важные пищеварительные ферменты секретируются клетками тонкого кишечника.

Большая часть энергии, запасенной в растительной пище, такой, как трава или сено, сосредоточена в целлюлозе, которую расщепляет фермент целлюлаза. В организме травоядных животных этот фермент не синтезируется, и жвачные, например крупный рогатый скот и овцы, могут питаться содержащей целлюлозу пищей только потому, что целлюлазу вырабатывают микроорганизмы, заселяющие первый отдел желудка - рубец. С помощью микроорганизмов происходит переваривание пищи и у термитов.

Ферменты находят применение в пищевой, фармацевтической, химической и текстильной промышленности. В качестве примера можно привести растительный фермент, получаемый из папайи и используемый для размягчения мяса. Ферменты добавляют также в стиральные порошки.

Ферменты в медицине и сельском хозяйстве . Осознание ключевой роли ферментов во всех клеточных процессах привело к широкому их применению в медицине и сельском хозяйстве. Нормальное функционирование любого растительного и животного организма зависит от эффективной работы ферментов. В основе действия многих токсичных веществ (ядов) лежит их способность ингибировать ферменты; таким же эффектом обладает и ряд лекарственных препаратов. Нередко действие лекарственного препарата или токсичного вещества можно проследить по его избирательному влиянию на работу определенного фермента в организме в целом или в той или иной ткани. Например, мощные фосфорорганические инсектициды и нервно-паралитические газы, разработанные в военных целях, оказывают свой губительный эффект, блокируя работу ферментов - в первую очередь холинэстеразы, играющей важную роль в передаче нервного импульса.

Чтобы лучше понять механизм действия лекарственных препаратов на ферментные системы, полезно рассмотреть, как работают некоторые ингибиторы ферментов. Многие ингибиторы связываются с активным центром фермента - тем самым, с которым взаимодействует субстрат. У таких ингибиторов наиболее важные структурные особенности близки к структурным особенностям субстрата, и если в реакционной среде присутствуют и субстрат и ингибитор, между ними наблюдается конкуренция за связывание с ферментом; при этом чем больше концентрация субстрата, тем успешнее он конкурирует с ингибитором. Ингибиторы другого типа индуцируют в молекуле фермента конформационные изменения, в которые вовлекаются важные в функциональном отношении химические группы. Изучение механизма действия ингибиторов помогает химикам создавать новые лекарственные препараты.

НЕКОТОРЫЕ ФЕРМЕНТЫ И КАТАЛИЗИРУЕМЫЕ ИМИ РЕАКЦИИ
Тип химической реакции	Фермент	Источник	Катализируемая реакция 1)
Гидролиз	Трипсин	Тонкий кишечник	Белки + H 2 O ® Разные полипептиды
Гидролиз	b -Амилаза	Пшеница, ячмень, батат и т.д.	Крахмал + H 2 O ® Гидролизат крахмала + Мальтоза
Гидролиз	Тромбин	Кровь	Фибриноген + H 2 O ® Фибрин + 2 Полипептида
Гидролиз	Липазы	Кишечник, семена с большим содержанием жиров, микроорганизмы	Жиры + H 2 O ® Жирные кислоты + Глицерин
Гидролиз	Щелочная фосфатаза	Почти все клетки	Органические фосфаты + H 2 O ® Дефосфорилированный продукт + Неорганический фосфат
Гидролиз	Уреаза	Некоторые растительные клетки и микроорганизмы	Мочевина + H 2 O ® Аммиак + Диоксид углерода
Фосфоролиз	Фосфорилаза	Ткани животных и растений, содержащие полисахариды	Полисахарид (крахмал или гликоген из n молекул глюкозы) + Неорганический фосфат Глюкозо-1-фосфат + Полисахарид (n – 1 глюкозных единиц)
Декарбоксилирование	Декарбоксилаза	Дрожжи, некоторые растения и микроорганизмы	Пировиноградная кислота ® Ацетальдегид + Диоксид углерода
Конденсация	Альдолаза		2 Триозофосфата Гексозодифосфат
Конденсация	Оксалоацетат-трансаце- тилаза	То же	Щавелевоуксусная кислота + Ацетил- кофермент А Лимонная кислота + Кофермент А
Изомеризация	Фосфогексозоизомераза	То же	Глюкозо-6-фосфат Фруктозо-6-фосфат
Гидратация	Фумараза	То же	Фумаровая кислота + H 2 O Яблочная кислота
Гидратация	Карбоангидраза	Разные ткани животных; зеленые листья	Диоксид углерода + H 2 O Угольная кислота
Фосфорилирование	Пируваткиназа	Почти все (или все) клетки	АТФ + Пировиноградная кислота Фосфоенолпировиноградная кислота + АДФ
Перенос фосфатной группы	Фосфоглюкомутаза	Все животные клетки; многие растения и микроорганизмы	Глюкозо-1-фосфат Глюкозо-6- фосфат
Переаминирование	Трансаминаза	Большинство клеток	Аспарагиновая кислота + Пировино- градная кислота Щавелевоуксусная кислота + Аланин
Синтез, сопряженный с гидролизом АТФ	Глутаминсинтетаза	То же	Глутаминовая кислота + Аммиак + АТФ Глутамин + АДФ + Неорганический фосфат
Окисление-восстановление	Цитохромоксидаза	Все животные клетки, многие растения и микроорганизмы	O 2 + Восстановленный цитохром c ® Окисленный цитохром c + H 2 O
Окисление-восстановление	Оксидаза аскорбиновой кислоты	Многие растительные клетки	Аскорбиновая кислота + O 2 ® Дегидроаскорбиновая кислота + Пероксид водорода
Окисление-восстановление	Цитохром c редуктаза	Все животные клетки; многие растения и микроорганизмы	НАД ·Н (восстановленный кофермент) + Окисленный цитохром c ® Восстановленный цитохром c + НАД (окисленный кофермент)
Окисление-восстановление	Лактатдегидрогеназа	Большинство животных кле - ток; некоторые растения и микроорганизмы	Молочная кислота + НАД (окисленный кофермент) Пировиноградная кислота + НАД ·Н (восстановленный кофермент)
1) Одинарная стрелка означает, что реакция идет фактически в одну сторону, а двойные стрелки – что реакция обратима.

ЛИТЕРАТУРА

Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов . М., 1980
Страйер Л. Биохимия , т. 1 (с. 104-131), т. 2 (с. 23-94). М., 1984-1985
Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохомия человека , т. 1. М., 1993

· Структура и механизм действия ферментов · Множественные формы ферментов · Медицинское значение · Практическое использование · Примечания · Литература ·

Активность ферментов определяется их трёхмерной структурой.

Активный центр ферментов

Изучение механизма химической реакции, катализируемой ферментом наряду с определением промежуточных и конечных продуктов на разных стадиях реакции подразумевает точное знание геометрии третичной структуры фермента, природы функциональных групп его молекулы, обеспечивающих специфичность действия и высокую каталитическую активность на этот субстрат, и кроме этого химической природы участка (участков) молекулы фермента, который обеспечивает высокую скорость каталитической реакции. Обычно молекулы субстрата, участвующие в ферментативных реакциях, по сравнению с молекулами ферментов имеют относительно небольшие размеры. Таким образом, при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственное химическое взаимодействие вступают лишь ограниченные фрагменты аминокислотной последовательности полипептидной цепи - «активный центр» - уникальная комбинация остатков аминокислот в молекуле фермента, обеспечивающая непосредственное взаимодействие с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа.

В активном центре условно выделяют:

каталитический центр - непосредственно химически взаимодействующий с субстратом;
связывающий центр (контактная или «якорная» площадка) - обеспечивающий специфическое сродство к субстрату и формирование комплекса фермент-субстрат.

Чтобы катализировать реакцию, фермент должен связаться с одним или несколькими субстратами. Белковая цепь фермента сворачивается таким образом, что на поверхности глобулы образуется щель, или впадина, где связываются субстраты. Эта область называется сайтом связывания субстрата. Обычно он совпадает с активным центром фермента или находится вблизи него. Некоторые ферменты содержат также сайты связывания кофакторов или ионов металлов.

Фермент, соединяясь с субстратом:

очищает субстрат от водяной «шубы»
располагает реагирующие молекулы субстратов в пространстве нужным для протекания реакции образом
подготавливает к реакции (к примеру, поляризует) молекулы субстратов.

Обычно присоединение фермента к субстрату происходит за счет ионных или водородных связей, редко - за счет ковалентных. В конце реакции её продукт (или продукты) отделяются от фермента.

В результате фермент снижает энергию активации реакции. Это происходит потому, что в присутствии фермента реакция идет по другому пути (по факту происходит другая реакция), к примеру:

В отсутствие фермента:

А+В = АВ

В присутствии фермента:

А+Ф = АФ
АФ+В = АВФ
АВФ = АВ+Ф

где А, В - субстраты, АВ - продукт реакции, Ф - фермент.

Ферменты не могут самостоятельно обеспечивать энергией эндергонические реакции (для протекания которых требуется энергия). Поэтому ферменты, осуществляющие такие реакции, сопрягают их с экзергоническими реакциями, идущими с выделением большего количества энергии. К примеру, реакции синтеза биополимеров зачастую сопрягаются с реакцией гидролиза АТФ.

Для активных центров некоторых ферментов характерно явление кооперативности.

Специфичность

Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам (субстратная специфичность). Это достигается частичной комплементарностью формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре связывания субстрата на ферменте. Ферменты обычно демонстрируют также высокий уровень стереоспецифичности (образуют в качестве продукта только один из возможных стереоизомеров или используют в качестве субстрата только один стереоизомер), региоселективности (образуют или разрывают химическую связь только в одном из возможных положений субстрата) и хемоселективности (катализируют только одну химическую реакцию из нескольких возможных для данных условий). Несмотря на общий высокий уровень специфичности, степень субстратной и реакционной специфичности ферментов может быть различной. Например, эндопептидаза трипсин разрывает пептидную связь только после аргинина или лизина , если за ними не следует пролин, а пепсин гораздо менее специфичен и может разрывать пептидную связь, следующую за многими аминокислотами.

Модель «ключ-замок»

В 1890 г. Эмиль Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата. Такое предположение называется моделью «ключ-замок». Фермент соединяется с субстратом с образованием короткоживущего фермент-субстратного комплекса. В тоже время, не смотря на то, что эта модель объясняет высокую специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.

Модель индуцированного соответствия

В 1958 г. Дениел Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок». Ферменты, в основном, - не жесткие, а гибкие молекулы. Активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстрата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое даёт возможность ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответствия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния. Эта модель получила название «рука-перчатка».

Модификации

Многие ферменты после синтеза белковой цепи претерпевают модификации, без которых фермент не проявляет свою активность в полной мере. Такие модификации называются посттрансляционными модификациями (процессингом). Один из самых распространенных типов модификации - присоединение химических групп к боковым остаткам полипептидной цепи. Например, присоединение остатка фосфорной кислоты называется фосфорилированием, оно катализируется ферментом киназой. Многие ферменты эукариот гликозилированы, то есть модифицированы олигомерами углеводной природы.

Ещё один распространенный тип посттранляционных модификаций - расщепление полипептидной цепи. Например, химотрипсин (протеаза, участвующая в пищеварении), получается при выщеплении полипептидного участка из химотрипсиногена. Химотрипсиноген является неактивным предшественником химотрипсина и синтезируется в поджелудочной железе. Неактивная форма транспортируется в желудок, где превращается в химотрипсин. Такой механизм необходим для того, чтобы избежать расщепления поджелудочной железы и других тканей до поступления фермента в желудок. Неактивный предшественник фермента называют также «зимогеном».

Кофакторы ферментов

Некоторые ферменты выполняют каталитическую функцию сами по себе, безо всяких дополнительных компонентов. Однако есть ферменты, которым для осуществления катализа необходимы компоненты небелковой природы. Кофакторы могут быть как неорганическими молекулами (ионы металлов, железо-серные кластеры и др.), так и органическими (например, флавин или гем). Органические кофакторы, прочно связанные с ферментом, называют также простетическими группами. Кофакторы органической природы, способные отделяться от фермента, называют коферментами.

Фермент, который требует наличия кофактора для проявления каталитической активности, но не связан с ним, называется апо-фермент. Апо-фермент в комплексе с кофактором носит название холо-фермента. Большая часть кофакторов связано с ферментом нековалентными, но довольно прочными взаимодействиями. Есть и такие простетические группы, которые связаны с ферментом ковалентно, например, тиаминпирофосфат в пируватдегидрогеназе.

Регуляция работы ферментов

У некоторых ферментов есть сайты связывания малых молекул, они могут быть субстратами или продуктами метаболического пути, в который входит фермент. Они уменьшают или увеличивают активность фермента, что создает возможность для обратной связи.

Ингибирование конечным продуктом

Метаболический путь - цепочка последовательных ферментативных реакций. Зачастую конечный продукт метаболического пути является ингибитором фермента, ускоряющего первую из реакций данного метаболического пути. Если конечного продукта слишком много, то он действует как ингибитор для самого первого фермента, а если после этого конечного продукта стало слишком мало, то первый фермент опять активируется. Таким образом, ингибирование конечным продуктом по принципу отрицательной обратной связи - важный способ поддержания гомеостаза (относительного постоянства условий внутренней среды организма).

Влияние условий среды на активность ферментов

Активность ферментов зависит от условий в клетке или организме - давления, кислотности среды, температуры, концентрации растворённых солей (ионной силы раствора) и др.

История развития науки о ферментах

В основе всех жизненных процессов лежат тысячи химических реакций. Они идут в организме без применения высокой температуры и давления, т. е. в мягких условиях. Вещества, котopыe окисляются в клетках человека и животных, сгорают быстро и эффективно, обогащая организм энергией и строительным материалом. Но те же вещества могут годами храниться как в консервированном (изолированном от воздуха) виде, так и на воздухе в присутствии кислорода. Например, мясные и рыбные консервы, пастеризованное молоко, сахар, крупы не разлагаются при довольно длительном хранении. Возможность быстрого переваривания продуктов в живом организме осуществляется благодаря присутствию в клетках особых биологических катализаторов - ферментов.

Ферменты - это специфические белки, входящие в состав всех клеток и тканей живых организмов, играющие роль биологических катализаторов. О ферментах люди узнали давно. Еще в начале прошлого века в Петербурге К. С. Кирхгоф выяснил, что проросший ячмень способен превращать полисахарид крахмал в дисахарид мальтозу, а экстракт дрожжей расщеплял свекловичный сахар на моносахариды - глюкозу и фруктозу. Это были первые исследования в ферментологии. А практическое применение ферментативных процессов было известно с незапамятных времен. Это и сбраживание винограда, и закваска при приготовлении хлеба, и сыроварение, и многое другое.

Сейчас в разных учебниках, пособиях и в научной литературе применяются два понятия: «ферменты» и «энзимы». Эти названия идентичны. Они обозначают одно и то же - биологические катализаторы. Первое слово переводится как «закваска», второе - «в дрожжах».

Долгое время не представляли, что же происходит в дрожжах, какая сила, присутствующая в них, заставляет вещества разрушаться и превращаться в более простые. И только после изобретения микроскопа было установлено, что дрожжи - это скопление большого количества микроорганизмов, которые используют сахар в качестве своего основного питательного вещества. Иными словами, каждая дрожжевая клетка «начинена» ферментами, способными разлагать сахар. Но в то же время были известны и другие биологические катализаторы, не заключенные в живую клетку, а свободно «обитающие» вне ее. Например, они были найдены в составе желудочных соков, клеточных экстрактов. В связи с этим в прошлом различали два типа катализаторов: считалось, что собственно ферменты неотделимы от клетки и вне ее не могут функционировать, т. е. они «организованы». А «неорганизованные» катализаторы, которые могут работать вне клетки, называли энзимами. Такое противопоставление «живых» ферментов и «неживых» энзимов объяснялось влиянием виталистов, борьбой материализма и идеализма в естествознании. Точки зрения ученых разделились. Основоположник микробиологии Л. Пастер утверждал, что деятельность ферментов определяется жизнью клетки. Если клетку разрушить, то прекратится и действие фермента. Химики во главе с Ю. Либихом развивали чисто химическую теорию брожения, доказывая, что активность ферментов не зависит от существования клетки.

В 1871 г. русский врач М. М. Манассеина разрушила дрожжевые клетки, растирая их с речным песком. Клеточный сок, отделенный от остатков клеток, сохранял свою способность сбраживать сахар. Этот простой и убедительный опыт русского врача остался без должного внимания в царской России. Через четверть века немецкий ученый Э. Бухнер получил бесклеточный сок прессованием живых дрожжей под давлением до 5·10 6 Па. Этот сок, подобно живым дрожжам, сбраживал сахар с образованием спирта и оксида углерода (IV):

Работы А. Н. Лебедева по исследованию дрожжевых клеток и труды других ученых положили конец виталистическим представлениям в теории биологического катализа, а термины «фермент» и «энзим» стали применять как равнозначные.

В наши дни ферментология - это самостоятельная наука. Выделено и изучено около 2000 ферментов. Вклад в эту науку внесли советские ученые - наши современники А. Е. Браунштейн, В. Н. Орехович, В. А. Энгельгард, А. А. Покровский и др.

Химическая природа ферментов

В конце прошлого века было высказано предположение, что ферменты - это белки или какие-то вещества, очень похожие на белки. Потеря активности фермента при нагревании очень напоминает тепловую денатурацию белка. Диапазон температур при денатурации и при инактивации одинаков. Как известно, денатурация белка может быть вызвана не только нагреванием, но и действием кислот, солей тяжелых металлов, щелочей, длительным облучением ультрафиолетовыми лучами. Эти же химические и физические факторы приводят к потере активности фермента.

В растворах ферменты, как и белки, ведут себя под действием электрического тока сходным образом: молекулы движутся к катоду или аноду. Изменение концентрации водородных ионов в растворах белков или ферментов приводит к накоплению ими положительного или отрицательного заряда. Это доказывает амфотерный характер ферментов и тоже подтверждает их белковую природу. Еще одно свидетельство белковой природы ферментов - они не проходят через полупропицаемые мембраны. Это также доказывает их большую молекулярную массу. Но если ферменты - это белки, то при дегидратации их активность не должна уменьшаться. Опыты подтверждают правильность такого предположения.

Интересный опыт был проведен в лаборатории И. П. Павлова. Получая желудочный сок через фистулу у собак, сотрудники обнаружили, что, чем больше белка в соке, тем больше его активность, т. е. определяемый белок и есть фермент желудочного сока.

Таким образом, явления денатурации и подвижности в электрическом поле, амфотерность молекул, высокомолекулярная природа, способность осаждаться из раствора при действии водоотнимающих средств (ацетон или спирт) доказывают белковую природу ферментов.

К настоящему времени этот факт установлен многими, еще более тонкими физическими, химическими или биологическими методами.

Мы уже знаем, что белки бывают очень разные по составу и прежде всего они могут быть простыми или сложными. К каким же белкам относятся известные ныне ферменты?

Ученые различных стран установили, что многие ферменты - это простые белки. Это значит, что при гидролизе молекулы этих ферментов распадаются только до аминокислот. Ничего, кроме аминокислот, в гидролизате таких белков-ферментов обнаружить не удается. К простым ферментам относятся пепсин - фермент, переваривающий белки в желудке и содержащийся в желудочном соке, трипсин - фермент поджелудочного сока, папаин - растительный фермент, уреаза и др.

В сложные ферменты входят, кроме аминокислот, вещества, имеющие небелковую природу. Например, окислительно-восстановительные ферменты, встроенные в митохондрию, содержат, кроме белковой части, атомы железа, меди и другие термостабильные группы. Небелковой частью фермента могут быть и более сложные вещества: витамины, нуклеотиды (мономеры нуклеиновых кислот), нуклеотиды с тремя фосфорными остатками и т. д. Условились называть в таких сложных белках небелковую часть - кофермент, а белковую- апофермент.

Отличие ферментов от небиологических катализаторов

В школьных учебниках и пособиях по химии подробно разбирается действие катализаторов, дается представление об энергетическом барьере, энергии активации. Напомним только, что роль катализаторов заключается в их способности активировать молекулы веществ, вступающих в реакцию. Это приводит к снижению энергии активации. Реакция идет не в один, а в несколько этапов с образованием промежуточных соединений. Катализаторы не изменяют направление реакции, а только влияют на скорость достижения состояния химического равновесия. В катализируемой реакции всегда затрачивается меньше энергии по сравнению с некатализируемой. В ходе реакции фермент меняет свою упаковку, «напрягается» и по окончании реакции принимает исходную структуру, возвращается к первоначальной форме.

Ферменты те же катализаторы. Им свойственны все законы катализа. Но ферменты - белки, и это сообщает им особые свойства. Что же общего у ферментов с привычными для нас катализаторами, например платиной, оксидом ванадия (V) и другими неорганическими ускорителями реакций, а что их отличает?

Один и тот же неорганический катализатор может применяться в разных производствах. А фермент катализирует только одну реакцию или один вид реакции, т. е. он более специфичен, чем неорганический катализатор.

Температура всегда влияет на скорости химических реакций. Большинство реакций с неорганическими катализаторами идет при очень высоких температурах. При повышении температуры скорость реакции, как правило, увеличивается (рис. 1). Для ферментативных реакций это увеличение ограничено определенной температурой (температурный оптимум). Дальнейшее повышение температуры вызывает изменения в молекуле фермента, приводящие к уменьшению скорости реакции (рис. 1). Но некоторые ферменты, например ферменты микроорганизмов, обнаруженных в воде горячих природных источников, не только выдерживают температуры, близкие к точке кипения воды, но и даже, проявляют свою максимальную активность. Для большинства же ферментов температурный оптимум близок к 35-45 °С. При более высоких температурах их активность уменьшается, а затем происходит полная тепловая денатурация.

Рис. 1. Влияние температуры на активность ферментов: 1 - увеличение скорости реакции, 2 - уменьшение скорости реакции.

Многие неорганические катализаторы проявляют свою максимальную эффективность в сильнокислой или сильно-щелочной среде. В отличие от них ферменты активны только при физиологических значениях кислотности раствора, только при такой концентрации ионов водорода, которая совместима с жизнью и нормальным функционированием клетки, органа или системы.

Реакции с участием неорганических катализаторов протекают, как правило, при высоких давлениях, а ферменты работают при нормальном (атмосферном) давлении.

И самым удивительным отличием фермента от других катализаторов является то, что скорость реакций, катализируемых ферментами, в десятки тысяч, а иногда и в миллионы раз выше той, которая может быть достигнута при участии неорганических катализаторов.

Известный всем пероксид водорода, применяемый в быту как отбеливающее и дезинфицирующее вещество, без катализаторов разлагается медленно:

В присутствии неорганического катализатора (солей железа) эта реакция идет несколько быстрее. А каталаза (фермент, присутствующий практически во всех клетках) разрушает пероксид водорода с невообразимой скоростью: одна молекула каталазы расщепляет в одну минуту более 5 млн. молекул Н 2 О 2 .

Универсальное распространение каталазы в клетках всех органов аэробных организмов и высокая активность этого фермента объясняются тем, что пероксид водорода - это мощный клеточный яд. Он получается в клетках как побочный продукт многих реакций, но на страже стоит фермент каталаза, который сейчас же разрушает пероксид водорода на безвредные кислород и воду.

Активный центр фермента

Обязательным этапом в катализируемой реакции является взаимодействие фермента с тем веществом, превращение которого он катализирует,- с субстратом: образуется фермент-субстратный комплекс. В приведенном выше примере пероксид водорода - это субстрат для действия каталазы.

Интересным оказывается то, что в ферментативных реакциях молекула субстрата во много раз меньше, чем молекула белка-фермента. Следовательно, субстрат не может контактировать со всей огромной молекулой фермента, а только с каким-то ее небольшим участком или даже отдельной группой, атомом. Для подтверждения этого предположения ученые отщепляли от фермента одну или несколько аминокислот, и это не влияло или почти не влияло на скорость катализируемой реакции. Но отщепление отдельных определенных аминокислот или группы приводило к полной потере каталитических свойств фермента. Так сформировалось представление об активном центре фермента.

Активный центр - это такой участок белковой молекулы, который обеспечивает соединение фермента с субстратом и дает возможность для дальнейших превращений субстрата. Были изучены некоторые активные центры разных ферментов. Это или функциональная группа (например, ОН-группа серина), или отдельная аминокислота. Иногда для обеспечения каталитического действия нужно несколько аминокислот в определенном порядке.

В составе активного центра выделяют различные по своим функциям участки. Одни участки активного центра обеспечивают сцепление с субстратом, прочный контакт с ним. Поэтому их называют якорными или контактными участками. Другие выполняют собственно каталитическую функцию, активируют субстрат - каталитические участки. Такое условное разделение активного центра помогает более точно представить механизм каталитической реакции.

Тип химической связи в фермент-субстратных комплексах тоже изучался. Вещество (субстрат) удерживается на ферменте при участии самых различных типов связей: водородных мостиков, ионных, ковалентных, донорно-акцепторных связей, ван-дер-ваальсовых сил сцепления.

Деформация молекул фермента в растворе приводит к появлению его изомеров, отличающихся третичной структурой. Иными словами, фермент ориентирует свои функциональные группы, входящие в активный центр, так, чтобы проявилась наибольшая каталитическая активность. Но и молекулы субстрата также могут деформироваться, «напрягаться» при взаимодействии с ферментом. Эти современные представления о фермент-субстратном взаимодействии отличаются от господствовавшей ранее теории Э. Фишера, который считал, что молекула субстрата точно соответствует активному центру фермента и подходит к нему как ключ к замку.

Свойства ферментов

Важнейшим свойством ферментов является преимущественное ускорение одной из нескольких теоретически возможных реакций. Это позволяет субстратам выбрать наиболее выгодные для организма цепочки превращений из целого ряда возможных путей.

В зависимости от условий ферменты способны катализировать как прямую, так и обратную реакции. Например, пировиноградная кислота под влиянием фермента лактатдегидрогеназы превращается в конечный продукт брожения - молочную кислоту. Этот же фермент катализирует и обратную реакцию, и само название он получил не по прямой, а по обратной реакции. Обе реакции происходят в организме при разных условиях:

Это свойство ферментов имеет большое практическое значение.

Другое важное свойство ферментов - термолабильность, т. е. высокая чувствительность к изменениям температуры. Мы уже говорили, что ферменты являются белками. Для большинства из них температура свыше 70 °С приводит к денатурации и потере активности. Из курса химии известно, что повышение температуры на 10 °С приводит к увеличению скорости реакции в 2-3 раза, что характерно и для ферментативных реакций, но до определенного предела. При температурах, близких к 0 °С, скорость ферментативных реакций замедляется до минимума. Это свойство широко используется в различных отраслях народного хозяйства, особенно в сельском хозяйстве и медицине. Например, все существующие сейчас способы консервации почки перед ее пересадкой больному включают охлаждение этого органа, чтобы снизить интенсивность биохимических реакций и продлить время жизни почки до ее пересадки человеку. Такой прием сохранил здоровье и спас жизнь десяткам тысяч людей в мире.

Рис. 2. Влияние pH на активность ферментов.

Одним из важнейших свойств белков-ферментов является их чувствительность к реакции среды, концентрации водородных ионов или гидроксид-ионов. Ферменты активны только в узком интервале кислотности или щелочности среды (pH). Например, активность пепсина в полости желудка максимальна при pH около 1 -1,5. Снижение кислотности приводит к глубокому нарушению пищеварительного акта, недоперевариванию пищи и тяжелым осложнениям. Из курса биологии вам известно, что пищеварение начинается уже в ротовой полости, где присутствует амилаза слюны. Оптимальное значение pH для нее 6,8-7,4. Для разных ферментов пищеварительного тракта характерны большие различия в оптимуме pH (рис. 2). Изменение реакции среды приводит к изменению зарядов на молекуле фермента или даже в его активном центре, вызывая снижение или полную потерю активности.

Следующим важным свойством является специфичность действия фермента. Каталаза расщепляет только пероксид водорода, уреаза - только мочевину H 2 N-СО-NH 2 , т. е. фермент катализирует превращение только одного субстрата, только его молекулу он «узнает». Такая специфичность считается абсолютной. Если фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих одинаковую функциональную группу, то такая специфичность называется групповой. Например, фосфатаза катализирует отщепление остатка фосфорной кислоты:

Разновидностью специфичности является чувствительность фермента только к одному изомеру - стерео-химическая специфичность.

Ферменты влияют на скорость превращения различных веществ. Но и на ферменты влияют некоторые вещества, резко изменяя их активность. Вещества, которые повышают активность ферментов, активизируют их, называются активаторами, а угнетающие их - ингибиторами. Ингибиторы могут подействовать на фермент необратимо. После их действия фермент уже никогда не может катализировать свою реакцию, так как его структура будет сильно изменена. Так действуют на фермент соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи. Обратимый ингибитор может быть удален из раствора, и фермент вновь приобретает активность. Такое обратимое ингибирование часто протекает по конкурентному типу, т. е. за активный центр борются субстрат и похожий на него ингибитор. Снять такое ингибирование можно, если увеличить концентрацию субстрата и вытеснить ингибитор с активного центра субстратом.

Важным свойством многих ферментов является то, что они находятся в тканях и клетках в неактивной форме (рис. 3). Неактивная форма ферментов называется проферментом. Классическими его примерами являются неактивные формы пепсина или трипсина. Существование неактивных форм ферментов имеет большое биологическое значение. Если бы пепсин или трипсин вырабатывались сразу в активной форме, то это приводило бы к тому, что, например, пепсин «переваривал» стенку желудка, т. е. желудок «переваривал» сам себя. Такого не происходит потому, что пепсин или трипсин становятся активными только после попадания в полость желудка или в тонкий кишечник: от пепсина под действием соляной кислоты, содержащейся в желудочном соке, отщепляется несколько аминокислот, и он приобретает способность расщеплять белки. А сам желудок предохранен теперь от действия пищеварительных ферментов слизистой оболочкой, выстилающей его полость.

Рис. 3 Схема превращения трипсиногена в активный трипсин: А - трипсиноген; Б - трипсин; 1 - место отрыва пептида; 2 - водородные связи; 3 - дисульфидный мостик; 4 - пептид, отщепленный при активации.

Процесс активации фермента идет, как правило, одним из четырех путей, представленных на рисунке 4. В первом случае отщепление пептида от неактивного фермента «открывает» активный центр и делает фермент активным.

Рис. 4 Пути активации ферментов (штриховкой отмечена молекула субстрата):

1 - отщепление от профермента небольшого участка (пептида) и превращение неактивного профермента в активный фермент; 2 - образование дисульфидных связей из SH-групп, освобождающее активный центр; 3 - образование комплекса белка с металлами, активирующее фермент: 4 образование комплекса фермента с каким-нибудь веществом (при этом освобождается доступ к активному центру).

Второй путь представляет собой образование дисульфидных S-S-мостиков, делающих доступным активный центр. В третьем случае присутствие металла активирует фермент, который может работать только в комплексе с этим металлом. Четвертый путь иллюстрирует активацию каким-то веществом, которое связывается с периферическим участком белковой молекулы и деформирует фермент таким образом, чтобы облегчить доступ субстрата к активному центру.

В последние годы обнаружен еще один способ регуляции активности ферментов Выяснилось, что один фермент, например лактатде-гидрогеназа, может находиться в нескольких молекулярных формах, отличающихся между собой, хотя они все катализируют одну реакцию. Такие различные по составу молекулы фермента, которые катализируют одну и ту же реакцию, встречаются даже внутри одной и той же клетки. Их называют изоферментами, т. е. изомерами фермента. У названной уже лактатдегидрогеназы найдено пять различных изоферментов. Какова роль нескольких форм одного фермента? Видимо, организм «подстраховывает» некоторые особенно важные реакции, когда при изменении условий в клетке работает то одна, то другая форма изофермента, и обеспечивает необходимую скорость и направление течения процесса.

И еще одно важное свойство ферментов. Часто они функционируют в клетке не отдельно друг от друга, а организованы в виде комплексов - ферментных систем (рис. 5): продукт предыдущей реакции - субстрат для последующей. Эти системы встроены в клеточные мембраны и обеспечивают быстрое направленное окисление вещества, «перебрасывая» его от фермента к ферменту. Синтетические процессы в клетке идут в подобных же ферментных системах.

Классификация ферментов

Круг вопросов, изучаемых ферментологией, широк. Количество ферментов, применяемых в здравоохранении, сельском хозяйстве, микробиологии и других отраслях науки и практики, велико. Это создавало трудность при характеристике ферментативных реакций, так как один и тот же фермент можно назвать или по субстрату, или по типу катализируемых реакций, или старым термином,прочно вошедшим в литературу: например пепсин, трипсин, каталаза.

Рис. 5. Предполагаемая структура мультиферментного комплекса, синтезирующего жирные кислоты (семь ферментных субъединиц отвечают за семь химических реакций).

Поэтому в 1961 г. Международный биохимический съезд в Москве утвердил классификацию ферментов, в основу которой положен тип реакции, катализируемой данным ферментом. В названии фермента обязательно присутствует название субстрата, т. е. того соединения, на которое воздействует данный фермент, и окончание -аза. Например, аргиназа катализирует гидролиз аргинина.

По этому принципу все ферменты были разделены на шесть классов.

1. Оксидоредуктазы-ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, например каталаза:

2. Трансферазы - ферменты, катализирующие перенос атомов или радикалов, например метилтрансферазы, переносящие СНз-группу:

3. Гидролазы - ферменты, разрывающие внутримолекулярные связи путем присоединения молекул воды, например фосфатаза:

4. Лиазы - ферменты, отщепляющие от субстрата ту или иную группу без присоединения воды, негидролитическим путем, например отщепление карбоксильной группы декарбоксилазой:

5. Изомеразы - ферменты, катализирующие превращение одного изомера в другой:

Глюкозо-6-фосфат-›глюкозо-1-фосфат

6. Ферменты, катализирующие реакции синтеза, например синтез пептидов из аминокислот. Этот класс ферментов носит название синтетаз.

Каждый фермент предложили закодировать шифром из четырех цифр, где первая из них обозначает номер класса, а остальные три характеризуют более подробно свойства фермента, его подкласс и индивидуальный номер в каталоге.

В качестве примера классификации ферментов приведем четырехзначный код, присвоенный пепсину,- 3.4.4Л. Цифра 3 обозначает класс фермента - гидролазы. Следующая цифра 4 кодирует подкласс пептидгидролаз, т. е. тех ферментов, которые гидролизуют именно пептидные связи. Еще одна цифра 4 обозначает под-подкласс, называемый пептидилпептидгидролазами. В этот подподкласс входят уже индивидуальные ферменты, и первым в нем значится пепсин, которому и присвоен порядковый номер 1.

Так получается его код - 3.4.4.1. Точки приложения действия ферментов класса гидролаз показаны на рисунке 6.

Рис. 6. Расщепление пептидных связей различными протеолитнческими ферментами.

Действие ферментов

Обычно ферменты выделяют из различных объектов животного, растительного или микробного происхождения и изучают их действие вне клетки и организма. Эти исследования очень важны для понимания механизма действия ферментов, изучения их состава, особенностей катализируемых ими реакций. Но полученные таким образом сведения нельзя механически непосредственно переносить на деятельность ферментов в живой клетке. Вне клетки трудно воспроизвести те условия, в которых работает фермент, например в митохондрии или лизосоме. К тому же не всегда известно, сколько из имеющихся молекул фермента участвует в реакции - все или только какая-то их часть.

Почти всегда оказывается, что клетка содержит тот или иной фермент, по содержанию превышающий в несколько десятков раз необходимое количество для осуществления нормального обмена веществ. Обмен веществ различен по интенсивности в разные периоды жизни клетки, однако ферментов в ней значительно больше, чем того требовал бы самый максимальный уровень обмена веществ. Например, в состав клеток сердечной мышцы входит столько цитохрома с, которое могло бы осуществить окисление, в 20 раз большее, чем максимальное потребление кислорода сердечной мышцей. Позднее были обнаружены вещества, которые могут «выключать» часть молекул ферментов. Это так называемые тормозящие факторы. Для понимания механизма действия ферментов важно и то, что в клетке они находятся не просто в растворе, а встроены в структуру клетки. Сейчас уже известно, какие ферменты вмонтированы в наружную мембрану митохондрии, какие встроены во внутреннюю, какие связаны с ядром, лизосомами и другими субклеточными структурами.

Близкое «территориальное» расположение фермента, катализирующего первую реакцию, к ферментам, катализирующим вторую, третью и последующие реакции, сильно влияет на суммарный результат их действия. Например, в митохондрии вмонтирована цепь ферментов, передающих электроны на кислород,- цитохромная система. Она катализирует окисление субстратов с образованием энергии, которая аккумулируется в АТФ.

При извлечении ферментов из клетки слаженность их совместной работы нарушается. Поэтому изучать работу ферментов стараются без разрушения тех структур, в которые встроены их молекулы. Например, если срез ткани подержать в растворе субстрата, а затем обработать реактивом, который с продуктами реакции даст окрашенный комплекс, то в микроскопе будут четко видны окрашенные участки клетки: в этих участках был локализован (расположен) фермент, который расщеплял субстрат. Так было установлено, в каких именно клетках желудка содержится пепсиноген, из которого получается фермент пепсин.

Сейчас широко распространен другой метод, который позволяет установить локализацию ферментов,- разделительное центрифугирование. Для этого исследуемую ткань (например, кусочки печени лабораторных животных) измельчают, а затем готовят из нее кашицу в растворе сахарозы. Смесь переносят в пробирки и вращают их с большими скоростями в центрифугах. Различные клеточные элементы в зависимости от их массы и размеров распределяются в плотном растворе сахарозы при вращении примерно следующим образом:

Для получения тяжелых ядер требуется относительно небольшое ускорение (меньшее число оборотов). После отделения ядер, увеличив число оборотов, последовательно осаждают митохондрии, микросомы, получают цитоплазму. Теперь активность ферментов можно изучать в каждой из выделенных фракций. Оказывается, что большинство из известных ферментов локализованы преимущественно в той или иной фракции. Например, фермент альдолаза локализован в цитоплазме, а фермент, окисляющий капроновую кислоту,- преимущественно в митохондриях.

При повреждении мембраны, в которую встроены ферменты, комплексные взаимосвязанные процессы не протекают, т. е. каждый фермент может действовать только сам по себе.

Клетки растений и микроорганизмов, как и клетки животных, содержат очень похожие клеточные фракции. Например, пластиды растений по ферментному набору напоминают митохондрии. В микроорганизмах обнаружены зерна, напоминающие рибосомы и тоже содержащие большие количества рибонуклеиновой кислоты. Ферменты, входящие в состав животных, растительных и микробных клеток, обладают сходным действием. Например, гиалуронидаза облегчает микробам проникновение в организм, способствуя разрушению клеточной стенки. Этот же фермент обнаружен в различных тканях животных организмов.

Получение и применение ферментов

Ферменты находятся во всех тканях животных и растений. Однако количество одного и того же фермента в разных тканях и прочность связи фермента с тканью неодинаковы. Поэтому практически его получение не всегда оправдано.

Источником получения ферментов могут быть пищеварительные соки человека и животных. В соках относительно мало посторонних примесей, клеточных элементов и других компонентов, от которых надо избавляться при получении чистого препарата. Это почти чистые растворы ферментов.

Из тканей получить фермент труднее. Для этого ткань измельчают, клеточные структуры разрушают, растирая измельченную ткань с песком, или обрабатывают ультразвуком. При этом ферменты «вываливаются» из клеток и мембранных структур. Их теперь очищают и отделяют друг от друга. Для очистки используют различную способность ферментов разделяться на хроматографических колонках, неодинаковую их подвижность в электрическом поле, осаждение их спиртом, солями, ацетоном и другие методы. Так как большинство ферментов связано с ядром, митохондриями, рибосомами или другими субклеточными структурами, сначала выделяют центрифугированием эту фракцию, а затем из нее извлекают фермент

Разработка новых методов очистки позволила получить ряд кристаллических ферментов в очень чистом виде, которые могут храниться годами.

Сейчас уже невозможно установить, когда люди впервые применили фермент, но можно с большой уверенностью утверждать, что это был фермент растительного происхождения. Люди давно обратили внимание на полезность того или иного растения не только как пищевого продукта. Например, аборигены Антильских островов издавна использовали сок дынного дерева для лечения язв и других кожных заболеваний.

Рассмотрим более подробно особенности получения и отрасли применения ферментов на примере одного из хорошо известных ныне растительных биокатализаторов - папаина. Этот фермент содержится в млечном соке во всех частях тропического плодового дерева папайи - гигантской древовидной травы, достигающей 10 м. Ее плоды похожи по форме и вкусу на дыню и содержат большое количество фермента папаина. Еще в начале XVI в. испанские мореплаватели обнаружили это растение в естественных условиях в Центральной Америке. Затем его завезли в Индию, а оттуда во все тропические страны. Васко да Гама, увидевший папайю в Индии, назвал ее золотым деревом жизни, а Марко Поло сказал, что папайя - это «дыня, вскарабкавшаяся на дерево». Мореплаватели знали, что плоды дерева спасают от цинги и дизентерии.

В нашей стране папайя растет на Черноморском побережье Кавказа, в ботаническом саду Академии наук России в специальных теплицах. Сырье для фермента - млечный сок - получают из надрезов на кожице плода. Затем сок сушат в лаборатории в вакуумных сушильных шкафах при невысоких температурах (не более 80 °С). Высушенный продукт растирают и хранят в стерильной упаковке, залитой парафином. Это уже достаточно активный препарат. Ферментативную активность его можно оценить по количеству расщепленного за единицу времени белка казеина. За одну биологическую единицу активности папаина принимают такое количество фермента, которого при введении в кровь достаточно для появления симптома «свисания ушей» у кролика массой 1 кг. Этот феномен происходит потому, что папаин начинает действовать на коллагеновые белковые нити в ушах кролика.

Папаин обладает целым спектром свойсте: протеолитическим, противовоспалительным, антикоагуляционным (препятствующим свертыванию крови), дегидратационным, болеутоляющим и бактерицидным. Он разрушает белки до полипептидов и аминокислот. Причем это расщепление идет глубже, чем при действии других ферментов животного и бактериального происхождения. Особенностью папаина является его способность быть активным в широком интервале pH и при больших колебаниях температуры, что особенно важно и удобно для широкого применения этого фермента. А если к тому же учесть, что для получения ферментов, сходных по действию с папаином (пепсин, трипсин, лидаза), требуются кровь, печень, мышцы или другие ткани животных, то преимущество и экономическая эффективность растительного фермента папаина несомненны.

Области применения папаина очень разнообразны. В медицине он используется для обработки ран, где способствует расщеплению белков поврежденных тканей и очищает раневую поверхность. Незаменим папаин при лечении различных заболеваний глаз. Он вызывает рассасывание помутневших структур органа зрения, делая их прозрачными. Известно положительное действие фермента при заболеваниях органов пищеварения. Хорошие результаты получены при применении папаина для лечения кожных болезней, ожогов, а также в невропатологии, урологии и других отраслях медицины.

Кроме медицины, большое количество этого фермента расходуется в виноделии и пивоварении. Папаин увеличивает сроки хранения напитков. При обработке папаином мясо становится мягким и быстроусваиваемым, сроки хранения продуктов резко увеличиваются. Шерсть, идущая в текстильную промышленность, после обработки папаином не скручивается и не сопровождается усадкой. Недавно папаин начали применять в кожевенном производстве. Кожаные изделия после обработки ферментом становятся мягкими, эластичными, более прочными и долговечными.

Тщательное изучение некоторых неизлечимых ранее болезней привело к необходимости вводить в организм недостающие ферменты для замены тех, активность которых снижена. Можно было бы ввести в организм необходимое количество недостающих ферментов или «добавить» молекулы тех ферментов, которые в органе или ткани снизили свою каталитическую активность. Но на эти ферменты организм реагирует как на чужеродные белки, отторгает их, вырабатывает на них антитела, что в конце концов приводит к быстрому распаду введенных белков. Ожидаемого терапевтического эффекта не будет. Вводить ферменты с пищей тоже нельзя, так как пищеварительные соки их «переварят» и они потеряют свою активность, распадутся до аминокислот, не дойдя до клеток и тканей. Введение ферментов прямо в кровоток приводит их к разрушению тканевыми протеазами. Устранить эти трудности удается, применяя иммобилизованные ферменты. В основе принципа иммобилизации лежит способность ферментов «привязываться» к стабильному носителю органической или неорганической природы. Примером химического связывания фермента с матрицей (носителем) является образование прочных ковалентных связей между их функциональными группами. Матрицей может быть, например, пористое стекло, содержащее функциональные аминогруппы, к которым химически «привязывают» фермент.

При применении ферментов часто возникает необходимость сравнивать их активности. Как узнать более активный фермент? Как рассчитать активность разных очищенных препаратов? Условились за активность фермента принимать количество субстрата, которое за одну минуту может превратить 1 г ткани, содержащий этот фермент, при 25 °С. Чем больше субстрата переработал фермент, тем он активнее. Активность одного и того же фермента меняется в связи с возрастом, полом, временем суток, состоянием организма, а также зависит от желез внутренней секреции, вырабатывающих гормоны.

Природа почти не ошибается, производя одинаковые белки в течение всей жизни организма и передавая эту строгую информацию о производстве тех же белков из поколения в поколение. Однако иногда в организме появляется измененный белок, в составе которого встречается одна или несколько «лишних» аминокислот или, наоборот, они утрачены. В настоящее время известно много таких молекулярных ошибок. Они объясняются разными причинами и могут вызвать болезненные изменения в организме. Такие болезни, в появлении которых повинны ненормальные молекулы белка, получили в медицине название молекулярных. Например, гемоглобин здорового человека, состоящий из двух полипептидных цепей (а и в), и гемоглобин больного серповидно-клеточной анемией (эритроцит имеет форму серпа) отличаются только тем, что у больных в в-цепи глутаминовая кислота заменена валином. Серповидно-клеточная анемия - это наследственная болезнь. Изменения гемоглобина передаются от родителей потомству.

Болезни, возникающие при изменении активности ферментов, называются ферментопатиями. Они, как правило, наследуются, передаются от родителей детям. Например, при врожденной фенилкетонурии нарушается следующее превращение:

При недостатке фермента фенилаланингидроксилазы фенилаланин не превращается в тирозин, а накапливается, что вызывает расстройство нормальной функции ряда органов, в первую очередь расстройство функции центральной нервной системы. Болезнь развивается с первых дней жизни ребенка, и к шести-семи месяцам жизни появляются ее первые симптомы. В крови и моче таких больных можно обнаружить огромные по сравнению с нормой количества фенилаланина. Своевременное выявление такой патологии и уменьшение приема той пищи, которая содержит много фенилаланина, оказывает положительное лечебное действие.

Другой пример: отсутствие у детей фермента, превращающего галактозу в глюкозу, приводит к накоплению в организме галактозы, которая в больших количествах накапливается в тканях и поражает печень, почки, глаза. Если отсутствие фермента обнаружено своевременно, то ребенка переводят на диету, не содержащую галактозу. Это ведет к исчезновению признаков заболевания.

Благодаря существованию ферментных препаратов расшифровывают структуру белков и нуклеиновых кислот. Без них невозможны производство антибиотиков, виноделие, хлебопечение, синтез витаминов. В сельском хозяйстве применяются стимуляторы роста, которые оказывают действие на активирование ферментативных процессов. Таким же свойством обладают многие лекарственные препараты, которые подавляют или активируют в организме деятельность ферментов.

Без ферментов невозможно представить себе развитие таких перспективных направлений, как воспроизводство химических процессов, происходящих в клетке, и создания на этой основе современной промышленной биотехнологии. Пока еще ни один современный химический завод не способен соперничать с обычным листком растения, в клетках которого с участием ферментов и солнечных лучей из воды и углекислого газа синтезируется огромное число разнообразных сложных органических веществ. При этом в атмосферу выделяется в большом количестве столь необходимый нам для жизни кислород.

Ферментология - молодая и перспективная наука, отделившаяся от биологии и химии и обещающая много удивительных открытий всем, кто решит заняться ею всерьез.

Скачать реферат: У вас нет доступа к скачиванию файлов с нашего сервера.

Структура и механизм действия ферментов

Как и все белки, ферменты синтезируются в виде линейной цепочки аминокислот, которая сворачивается определённым образом. Каждая последовательность аминокислот сворачивается особым образом, и получающаяся молекула (белковая глобула) обладает уникальными свойствами. Несколько белковых цепей могут объединяться в белковый комплекс. Третичная структура белков разрушается при нагревании или воздействии некоторых химических веществ.
Чтобы катализировать реакцию, фермент должен связаться с одним или несколькими субстратами. Белковая цепь фермента сворачивается таким образом, что на поверхности глобулы образуется щель, или впадина, где связываются субстраты. Эта область называется сайтом связывания субстрата.
Поскольку все ферменты являются белками (но не все белки - ферменты) остановимся подробнее на структуре белков

Белки́ - сложные высокомолекулярные природные органические вещества, построенные из

аминокислот , соединённых пептидными связями. Последовательность аминокислот в белке определена геном и зашифрована в генетическом коде. Хотя это генетическое кодирование определяет 20 "стандартных" аминокислот, расположение их в белке (протеине) дает возможность создания бесчисленного количества разных протеинов. Белки могут работать совместно, для того чтобы достигнуть определенной функции, и они часто связываются для того чтобы сформировать стабилизированный комплекс.

Модель 1,3-бета-D-глюканазы из
кристаллического стебелька
морского моллюска Spisula sachalinensis

Молекулы белков представляют собой линейные полимеры, состоящие из 20 основных L-α-аминокислот (которые являются мономерами) и, в некоторых случаях, из модифицированных основных аминокислот (правда модификации происходят уже после синтеза белка на рибосоме). Для обозначения аминокислот в научной литературе используются одно- или трёхбуквенные сокращения.

При образовании белка в результате взаимодействия α-аминогруппы (-NH 2) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой (-СООН) другой аминокислоты образуются пептидные связи. Концы белка называют С- и N- концом (в зависимости от того, какая из групп концевой аминокислоты свободна: -COOH или -NH 2 , соответственно). При синтезе белка на рибосоме, новые аминокислоты присоединяются к C-концу, поэтому название пептида или белка даётся путём перечисления аминокислотных остатков начиная с N-конца.

Белки длиной от 2 до 100 аминокислотных остатков часто называют пептидами, при большей степени полимеризации - протеинами, хотя это деление весьма условно.

Последовательность аминокислот в белке соответствует информации, содержащейся в гене данного белка. Эта информация представлена в виде поcледовательности нуклеотидов, причем одной аминокислоте соответсвует одна или несколько последовательностей из трех нуклеотидов - так называемых триплетов или кодонов. То, какая аминокислота соответствует данному кодону в мРНК определяется генетическим кодом, который может несколько отличаться у разных организмов.

Гомологичные белки (выполняющие одну функцию и предположительно имеющие общее эволюционного происхождение, например, гемоглобины) разных организмов имеют во многих местах цепи различные аминокислотные остатки, называемые вариабельными, в противоположность инвариантным, общим остаткам. По степени гомологии возможна оценки эволюционного расстояния между таксонами.

Простые и сложные белки

Выделяют простые белки (протеины) и сложные белки (протеиды). Простые белки содержат только аминокислоты, связанные в цепочку. Сложные белки имеют также неаминокислотные группы. Эти дополнительные группы в составе сложных белков называются «простетическими группами». Многие белки эукариот, например, имеют полисахаридные цепи, которые помогают белку принимать нужную конформацию и придают дополнительную стабильность. Дисульфидные мостики также играют роль как элементы необходимые при принятии белком правильной 3-х мерной формы, и являются главным компонентом сложных белков. Но важно заметить, что в основном только эукариоты способны на синтезирование сложных белков (протеидов), так как прокариоты не имеют достаточно компартментализации для создания дополнительных изменений, присутствующих в сложных белках, и даже если могут это делать в периплазматическом пространстве, то это случается либо редко, либо неэффективно.

Уровни структурной организации белков

Кроме последовательности (первичной структуры), крайне важна трехмерная структура белка, которая формируется в процессе фолдинга (от англ. folding, т.е. сворачивание). Показано, что несмотря на огромные размеры молекул, природные белки имеют лишь одну конформацию, утратившие структуру белки теряют свои свойства.
Выделяют четыре уровня структуры белка:
. Первичная структура — последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи.

Вторичная структура - локальное упорядочивание фрагмента полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. Ниже приведены некоторые распространенные типы вторичной структуры белков:
α-спирали - плотные витки вокруг длинной оси молекулы, один виток составляют 4 аминокислотных остатка, спираль стабилизорована водородными связями между H и O пептидных групп, отстоящих друг от друга на 4 звена. Спираль может быть построена исключительно из одного типа стереоизомеров аминокислот (L или D), хотя она может быть как левозакрученной, так и правозакрученной, в белках преобладает правозакрученная. Спираль нарушают электростатические взаимодействия глутаминовой кислоты, лизина, аргинина, близкорасположенные аспарагин, серин, треонин и лейцин могут стерически мешать образованию спирали, пролин вызывает изгиб цепи и также нарушает α-спирали.
β-листы (складчатые слои) - несколько зигзагообразных полипептидных цепей, в которых водородные связи образуются между разными цепями, а не внутри одной, как имеет место в α-спирали. Эти цепи обычно направлены N-концами в разные стороны (антипараллельная ориентация). Для образования листов важны небольшие размеры R-групп аминокислот, преобладают обычно глицин и аланин.
неупорядоченные фрагменты. ъ

Третичная структура
- пространственное строение полипептидной цепи - взаимное расположение элементов вторичной структуры, стабилизированное взаимодействием между боковыми цепями аминокислотных остатков. В стабилизации третичной структуры принимают участие:
ковалентные связи (между двумя цистеинами - дисульфидные мостики);
ионные (электростатические) взаимодействия (между противоположно заряженными аминокислотными остатками);
водородные связи;
гидрофобные взаимодействия.

Четверичная структура
- субъединичная структура белка. Взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса.