Ονομάζεται έτσι επειδή οι περισσότερες διαδικασίες μεταγραφής σε ζωντανούς οργανισμούς συμβαίνουν σε διαφορετική κατεύθυνση, δηλαδή, ένα μεταγράφημα RNA συντίθεται από ένα μόριο DNA.
Ιστορία
Η αντίστροφη μεταγραφάση ανακαλύφθηκε από τον Howard Temin στο Πανεπιστήμιο του Wisconsin-Madison και ανεξάρτητα από τον David Baltimore το 1970. Και οι δύο ερευνητές μοιράστηκαν το Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής το 1975 με τον Renato Dulbecco.
Ακρίβεια μεταγραφής
Η αντίστροφη μεταγραφή από RNA σε DNA συνοδεύεται από υψηλό επίπεδολάθη μετάφρασης, αυτό διακρίνει την αντίστροφη μεταγραφάση από άλλες πολυμεράσες DNA. Αυτά τα σφάλματα μπορεί να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις που ευθύνονται για την ανθεκτικότητα των ιών στα φάρμακα.
Σημασία για ιούς
Απαιτείται αντίστροφη μεταγραφή ειδικότερα για τη διεξαγωγή του κύκλου ζωής των ρετροϊών, όπως οι ιοί ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και το λέμφωμα ανθρώπινου Τ-κυττάρου τύπου 1 και 2. Αφού το ιικό RNA εισέλθει στο κύτταρο, η αντίστροφη μεταγραφάση που περιέχεται στα ιικά σωματίδια συνθέτει το συμπληρωματικό DNA της και στη συνέχεια, σε αυτόν τον κλώνο DNA, όπως σε μια μήτρα, συμπληρώνει τον δεύτερο κλώνο.
Σημασία για τους ευκαρυώτες
Εφαρμογή
Αντιρετροϊκή θεραπεία
Ρόλος στη γενετική μηχανική
Στη γενετική μηχανική, η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται για την παραγωγή cDNA, ένα αντίγραφο ενός ευκαρυωτικού γονιδίου που δεν περιέχει εσώνια. Για να γίνει αυτό, το ώριμο mRNA (που κωδικοποιεί το αντίστοιχο γονιδιακό προϊόν: πρωτεΐνη, RNA) απομονώνεται από το σώμα και πραγματοποιείται αντίστροφη μεταγραφή με αυτό ως πρότυπο. Το cDNA που προκύπτει μπορεί να μετασχηματιστεί σε βακτηριακά κύτταρα για να ληφθεί ένα διαγονιδιακό προϊόν.
δείτε επίσης
Γράψτε μια κριτική για το άρθρο "Αντίστροφη μεταγραφάση"
Σημειώσεις
Ένα απόσπασμα που χαρακτηρίζει την αντίστροφη μεταγραφάση
- Ω! σχετικά με! σχετικά με!- Λοιπόν, αντίο, Μπολκόνσκι! Αντίο, πρίγκιπα. ελάτε για φαγητό νωρίτερα, - ακολούθησαν φωνές. - Σε φροντίζουμε.
«Προσπαθήστε όσο το δυνατόν περισσότερο να επαινείτε την τάξη στην παράδοση των προμηθειών και των διαδρομών όταν μιλάτε με τον αυτοκράτορα», είπε ο Bilibin, συνοδεύοντας τον Bolkonsky στο μέτωπο.
«Και θα ήθελα να επαινέσω, αλλά δεν μπορώ, από όσο ξέρω», απάντησε ο Μπολκόνσκι χαμογελώντας.
Λοιπόν, μίλα όσο περισσότερο μπορείς. Το πάθος του είναι το κοινό. αλλά δεν του αρέσει να μιλάει και δεν ξέρει πώς, όπως θα δείτε.
Στην έξοδο, ο αυτοκράτορας Φραντς κοίταξε μόνο προσεκτικά το πρόσωπο του πρίγκιπα Αντρέι, που στεκόταν στο καθορισμένο μέρος μεταξύ των Αυστριακών αξιωματικών, και του έγνεψε το μακρύ κεφάλι του. Αλλά μετά την αποχώρησή του από τη χθεσινή πτέρυγα βοηθών, μετέφερε ευγενικά στον Bolkonsky την επιθυμία του αυτοκράτορα να του δώσει ένα ακροατήριο.
Ο αυτοκράτορας Φραντς τον δέχτηκε, στεκόμενος στη μέση του δωματίου. Πριν ξεκινήσει τη συζήτηση, ο πρίγκιπας Αντρέι εντυπωσιάστηκε από το γεγονός ότι ο αυτοκράτορας φαινόταν να είναι μπερδεμένος, χωρίς να ξέρει τι να πει και κοκκίνισε.
«Πες μου, πότε ξεκίνησε η μάχη;» ρώτησε βιαστικά.
απάντησε ο πρίγκιπας Άντριου. Μετά από αυτή την ερώτηση, ακολούθησαν άλλες εξίσου απλές ερωτήσεις: «Είναι υγιής ο Κουτούζοφ; πριν πόσο καιρό άφησε τον Κρεμς;» κ.λπ. Ο αυτοκράτορας μίλησε με τέτοια έκφραση σαν να ήταν όλος ο σκοπός του να κάνει μόνο έναν ορισμένο αριθμό ερωτήσεων. Οι απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα, όπως ήταν πολύ προφανές, δεν μπορούσαν να τον ενδιαφέρουν.
Σε ποια ώρα ξεκίνησε η μάχη; ρώτησε ο αυτοκράτορας.
«Δεν μπορώ να πω στη μεγαλειότητά σας πότε ξεκίνησε η μάχη από το μέτωπο, αλλά στο Dürenstein, όπου βρισκόμουν, ο στρατός εξαπέλυσε επίθεση στις 6 το βράδυ», είπε ο Bolkonsky, ξυπνώντας και ταυτόχρονα. με την προϋπόθεση ότι θα μπορούσε να παρουσιάσει αυτό που ήταν ήδη έτοιμο στο κεφάλι του μια αληθινή περιγραφή όλων όσων ήξερε και είδε.
Όμως ο αυτοκράτορας χαμογέλασε και τον διέκοψε:
- Πόσα μίλια;
«Από πού και ως πού, Μεγαλειότατε;»
– Από το Dürenstein στο Krems;
«Τριάμισι μίλια, Μεγαλειότατε.
Έφυγαν οι Γάλλοι από την αριστερή όχθη;
- Όπως ανέφεραν οι πρόσκοποι, οι τελευταίοι διέσχιζαν σε σχεδίες τη νύχτα.
– Υπάρχει αρκετή χορτονομή στο Krems;
- Η χορτονομή δεν παραδόθηκε σε αυτή την ποσότητα ...
Ο αυτοκράτορας τον διέκοψε.
«Τι ώρα σκοτώθηκε ο στρατηγός Σμιτ;»
«Επτά η ώρα, νομίζω.
- Στις 7:00. Πολύ λυπηρό! Πολύ λυπηρό!
Ο αυτοκράτορας είπε ότι ήταν ευγνώμων και υποκλίθηκε. Ο πρίγκιπας Αντρέι βγήκε έξω και περικυκλώθηκε αμέσως από όλες τις πλευρές από αυλικούς. Στοργικά μάτια τον κοίταξαν από όλες τις πλευρές και ακούστηκαν στοργικά λόγια. Η χθεσινή πτέρυγα βοηθού τον επέπληξε που δεν σταμάτησε στο παλάτι και του πρόσφερε το σπίτι του. Ο Υπουργός Πολέμου τον πλησίασε, δίνοντάς του συγχαρητήρια για το παράσημο της Μαρίας Θηρεσίας του 3ου βαθμού, που του είχε απονείμει ο Αυτοκράτορας. Η καμαριέρα της αυτοκράτειρας τον κάλεσε στο μεγαλείο της. Ήθελε να τον δει και η Αρχιδούκισσα. Δεν ήξερε σε ποιον να απαντήσει και για λίγα δευτερόλεπτα μάζεψε τις σκέψεις του. Ο Ρώσος απεσταλμένος τον πήρε από τον ώμο, τον οδήγησε στο παράθυρο και άρχισε να του μιλάει.
Σε αντίθεση με τα λόγια του Bilibin, τα νέα που έφερε έγιναν δεκτά με χαρά. Είχε προγραμματιστεί μια ακολουθία των ευχαριστιών. Ο Κουτούζοφ τιμήθηκε με τον Μεγαλόσταυρο από τη Μαρία Θηρεσία και ολόκληρος ο στρατός έλαβε παράσημα. Ο Μπολκόνσκι έλαβε προσκλήσεις από όλες τις πλευρές και έπρεπε να κάνει επισκέψεις στους κύριους αξιωματούχους της Αυστρίας όλο το πρωί. Αφού τελείωσε τις επισκέψεις του στις πέντε το απόγευμα, συνθέτοντας νοερά μια επιστολή στον πατέρα του για τη μάχη και για το ταξίδι του στο Μπρουν, ο πρίγκιπας Αντρέι επέστρεψε στο σπίτι στο Μπίλιμπιν. Στη βεράντα του σπιτιού που καταλάμβανε ο Μπίλιμπιν, υπήρχε μια μπρίτζκα μισοστοιχισμένη με πράγματα και ο Φραντς, ο υπηρέτης του Μπίλιμπιν, σέρνοντας τη βαλίτσα με δυσκολία, βγήκε από την πόρτα.
Κατά τη μελέτη ρετροϊών, το γονιδίωμα των οποίων αντιπροσωπεύεται από μονόκλωνα μόρια RNA, διαπιστώθηκε ότι κατά τη διαδικασία της ενδοκυτταρικής ανάπτυξης περνούν από το στάδιο της ενσωμάτωσης του γονιδιώματός τους με τη μορφή δίκλωνου DNA στα χρωμοσώματα του ξενιστή κύτταρο. Το 1964, ο X. Temin υπέβαλε μια υπόθεση σχετικά με την ύπαρξη ενός ειδικού για τον ιό ενζύμου ικανού να συνθέτει συμπληρωματικό DNA σε ένα πρότυπο RNA. Το 1970, οι X. Temin και S. Mizutani, καθώς και ανεξάρτητα ο D. Baltimore, ανακάλυψαν ένα τέτοιο ένζυμο σε ένα παρασκεύασμα εξωκυτταρικών ιοσωμάτων του ιού σαρκώματος Rous. Αυτή η εξαρτώμενη από RNA πολυμεράση DNA ονομάζεται ανάστροφη μεταγραφάση (αντίστροφη μεταγραφάση).
Η ρεβερτάση των ρετροϊών των πτηνών έχει μελετηθεί με τη μεγαλύτερη λεπτομέρεια. Κάθε βιριόν περιέχει περίπου 50 μόρια αυτού του ενζύμου. Η ανάστροφη μεταγραφάση αποτελείται από δύο υπομονάδες, την ά (65 kDa) και τη β (95 kDa), που υπάρχουν σε ισομοριακές ποσότητες. Η ά-υπομονάδα είναι το Ν-τελικό τμήμα (δύο τρίτα) της β-υπομονάδας.
Η ανάστροφη μεταγραφάση έχει τουλάχιστον τρεις ενζυματικές δραστηριότητες:
DNA πολυμεράση, χρησιμοποιώντας τόσο RNA όσο και DNA ως πρότυπο.
τη δραστηριότητα της RNase H, η οποία υδρολύει το RNA στο υβρίδιο RNA-DNA, αλλά όχι μονόκλωνο ή δίκλωνο RNA.
Ενδονουκλεάση DNA.
Οι δύο πρώτες δραστηριότητες απαιτούνται για τη σύνθεση ιικού DNA και η ενδονουκλεάση φαίνεται να είναι σημαντική για την ενσωμάτωση του ιικού DNA στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή. Η β-υπομονάδα της αναστροφάσης έχει και τις τρεις δραστηριότητες, ενώ η α-υπομονάδα έχει μόνο πολυμεράση και RNase H.
Η καθαρισμένη αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει DNA τόσο σε εκμαγεία RNA όσο και σε DNA. Για να ξεκινήσει η σύνθεση, η ρεβερσετάση, όπως και άλλες πολυμεράσες, χρειάζεται μια κοντή δίκλωνη περιοχή - ένα αστάρι. Ο εκκινητής μπορεί να είναι ένα μονόκλωνο τμήμα τόσο του RNA όσο και του DNA, το οποίο στην πορεία της αντίδρασης συνδέεται ομοιοπολικά με τον νεοσυντιθέμενο κλώνο DNA.
Η αντίστροφη μεταγραφάση χρησιμοποιείται κυρίως για τη μεταγραφή του αγγελιοφόρου RNA σε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής πραγματοποιείται παρουσία ισχυρών αναστολέων της δράσης της RNase. Σε αυτή την περίπτωση, είναι δυνατό να ληφθούν αντίγραφα DNA πλήρους μήκους των μορίων RNA στόχου. Το Oligo(dT) χρησιμοποιείται ως εκκινητής για την αντίστροφη μεταγραφή mRNA που περιέχει πολυ(Α) (Εικ.) και για μόρια RNA που δεν έχουν άκρα πολυ(Α) 3", χημικά συντιθέμενα ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς το άκρο 3". μελέτησε το RNA. Επιπλέον, ο τελευταίος τύπος μορίων RNA μπορεί να μετατραπεί σε μόρια που περιέχουν πολυ(Α) χρησιμοποιώντας πολυμεράση πολυ(Α) Ε. coli.
Μετά τη σύνθεση στο mRNA του συμπληρωματικού κλώνου DNA και την καταστροφή του RNA (συνήθως χρησιμοποιείται επεξεργασία με αλκάλια), συντίθεται ο δεύτερος κλώνος του DNA. Σε αυτήν την περίπτωση, χρησιμοποιείται η ικανότητα της ρεβερσετάσης να σχηματίζει αυτοσυμπληρωματικές φουρκέτες στα 3 "άκρα του μονόκλωνου cDNA, το οποίο μπορεί να λειτουργήσει ως εκκινητής. Η πρώτη έλικα του cDNA χρησιμεύει ως πρότυπο. Αυτή η αντίδραση μπορεί να καταλυθεί τόσο από την ρεβερσετάση όσο και από την πολυμεράση Ι DNA του Ε. coli. Ο συνδυασμός αυτών των δύο ενζύμων επιτρέπει την αύξηση της απόδοσης πλήρους δίκλωνων μορίων cDNA.
Με την ολοκλήρωση της σύνθεσης, ο πρώτος και ο δεύτερος κλώνος του cDNA παραμένουν ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με έναν βρόχο φουρκέτας, ο οποίος χρησίμευσε ως εκκινητήρας στη σύνθεση του δεύτερου κλώνου. Αυτός ο βρόχος διασπάται με ενδονουκλεάση S1, η οποία καταστρέφει ειδικά μονόκλωνες περιοχές. νουκλεϊκά οξέα. Τα άκρα που προκύπτουν δεν είναι πάντα αμβλεία και για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της επακόλουθης κλωνοποίησης, επιδιορθώνονται για να αμβλύνουν χρησιμοποιώντας το θραύσμα Klenow της πολυμεράσης Ι DNA του E. coli. Το προκύπτον δίκλωνο cDNA μπορεί στη συνέχεια να εισαχθεί σε φορείς κλωνοποίησης, να διαδοθεί ως υβριδικά μόρια DNA και να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω έρευνα.
Η ρεβερτάση είναι ένα ένζυμο που συνθέτει cDNA σε ένα πρότυπο RNA.
Σε ορισμένους ιούς, το γονιδίωμα δεν είναι DNA, ως συνήθως, αλλά RNA. Τέτοιοι ιοί ονομάζονταν ρετροϊοί (ρετρό - αντίστροφος). Το 1970, οι D. Baltimore και H.M. Temin ανακάλυψαν έναν μηχανισμό για τη μεταφορά πληροφοριών από το ιικό RNA στο DNA, δηλ. το αντίθετο από αυτό που συμβαίνει στα κύτταρα των ανώτερων οργανισμών. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή και το ένζυμο που την εκτελεί ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφάση ή ρεβερτάση.
Αντίστροφη μεταγραφάση, ή ρεβερτάση (αντίστροφη μεταγραφάση, [lat. μεταγραφή- επανεγγραφή) - το ένζυμο πολυμεράση DNA που εξαρτάται από το RNA, με τη βοήθεια του οποίου πραγματοποιείται η αντίστροφη μεταγραφή - Σύνθεση DNA σε πρότυπο RNA. κωδικοποιούνται από τα γονιδιώματα ορισμένων ιών που περιέχουν RNA και κινητά γενετικά στοιχεία του γονιδιώματος ανώτερων οργανισμών, ένα σημαντικό «εργαλείο» για τη γενετική μηχανική. Η ανάστροφη μεταγραφάση έχει τουλάχιστον τρεις ενζυματικές δραστηριότητες:
1) DNA πολυμεράση, χρησιμοποιώντας και RNA και DNA ως πρότυπο.
2) τη δραστηριότητα της RNase H, η οποία υδρολύει το RNA στο υβρίδιο RNA-DNA, αλλά όχι μονόκλωνο ή δίκλωνο RNA, και
3) Δραστικότητα ενδονουκλεάσης DNA.
Ανακαλύφθηκε ανεξάρτητα από τους D. Baltimore και H. Temin το 1970 σε ιούς όγκου που περιέχουν RNA (βραβείο Νόμπελ για το 1975, μαζί με τον R. Dulbecco).
Έτσι, οι αντίστροφες μεταγραφάσες είναι ικανές να συνθέσουν DNA σε ένα εκμαγείο RNA πολυμερίζοντας τέσσερις τριφωσφορικούς δεοξυριβονουκλεοζίτες. Και ακριβώς όπως οι πολυμεράσες DNA, λειτουργούν μόνο με την παρουσία ενός σπόρου.
Οι αντίστροφες τρανσκριπτάσες χρησιμοποιούνται στη σύνθεση δίκλωνου DNA συμπληρωματικού προς RNA (ειδικά mRNA) για την επακόλουθη κλωνοποίησή του σε πλασμιδικούς φορείς για τη λήψη βιβλιοθηκών cDNA (clonotecs). Οι αντίστροφες μεταγραφάσες, όπως οι πολυμεράσες DNA, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εισαγωγή μιας ραδιενεργής ή φθορίζουσας επισήμανσης σε ανιχνευτές DNA σε κατάλληλα σημασμένους τριφωσφορικούς δεοξυριβονουκλεοζίτες.
Η ικανότητα σύνθεσης DNA από ένα πρότυπο RNA υπό ορισμένες συνθήκες έχει αποδειχθεί για τη θερμοσταθερή πολυμεράση DNA Thermus thermophilus. Αυτό επιτρέπει τη χρήση του για την άμεση ανίχνευση ειδικών RNA σε βιολογικά δείγματα με PCR. Οι σύγχρονες τροποποιήσεις αυτής της προσέγγισης καθιστούν δυνατή σε ένα μείγμα αντίδρασης (και δοκιμαστικό σωλήνα) τη σύνθεση στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής ενός μικρού αριθμού αντιγράφων του ενισχυμένου θραύσματος DNA σε ένα πρότυπο RNA, τα οποία χρησιμοποιούνται αμέσως από το ίδιο ένζυμο ως πρότυπο σε συμβατική PCR (one tube PCR).
