Obiectele principale ale biotehnologiei sunt. Planul cursului. Obiecte și metode ale biotehnologiei. Învățarea de materiale noi

Biotehnologia reprezintă procese tehnologice care utilizează sisteme biotehnologice - organisme vii și componente ale unei celule vii. Sistemele pot fi diferite - de la microbi și bacterii la enzime și gene. Biotehnologia este o producție bazată pe realizările științei moderne: inginerie genetică, chimie fizică a enzimelor, diagnostic molecular și biologie moleculară, genetică a reproducerii, microbiologie, biochimie, chimia antibioticelor.

În domeniul producției de droguri, biotehnologia înlocuiește tehnologiile tradiționale și deschide noi oportunități fundamentale. Metodele biotehnologice produc proteine ​​modificate genetic (interferoni, interleukine, insulină, vaccinuri hepatitice etc.), enzime, instrumente de diagnostic (sisteme de testare pentru medicamente, medicamente, hormoni etc.), vitamine, antibiotice, materiale plastice biodegradabile, materiale biocompatibile.

Biotehnologia imună, cu ajutorul căreia celulele individuale sunt recunoscute și izolate din amestecuri, poate fi utilizată nu numai direct în medicină pentru diagnostic și tratament, ci și în cercetarea științifică, în industriile farmacologice, alimentare și în alte industrii și poate fi folosită și pentru obţine medicamente sintetizate de celule sistem de protectie organism.

În prezent, realizările biotehnologiei sunt promițătoare în următoarele industrii:

În industrie (alimentară, farmaceutică, chimică, petrol și gaze) - utilizarea biosintezei și biotransformării de noi substanțe pe baza tulpinilor de bacterii și drojdii modificate genetic cu proprietăți dorite pe baza sintezei microbiologice;

În ecologie - creșterea eficienței protecției ecologice a plantelor, dezvoltarea tehnologiilor de tratare a apelor uzate ecologice, reciclarea deșeurilor din complexul agroindustrial, proiectarea ecosistemelor;

În sectorul energetic - utilizarea de noi surse de bioenergie obținute pe baza sintezei microbiologice și a proceselor fotosintetice simulate, bioconversia biomasei în biogaz;

În agricultură - dezvoltare în domeniul producției vegetale a culturilor transgenice, produselor biologice de protecție a plantelor, îngrășăminte bacteriene, micro metode biologice, refacerea solului; în domeniul zootehniei - crearea de preparate furajere eficiente din biomasă vegetală, microbiană și deșeuri Agricultură, reproducerea animalelor pe baza metodelor embriogenetice;

În medicină - dezvoltarea de produse biologice medicale, anticorpi monoclonali, diagnostice, vaccinuri, dezvoltarea imunobiotehnologiei în direcția creșterii sensibilității și specificității imunotestării bolilor de natură infecțioasă și neinfecțioasă.

Comparativ cu tehnologia chimică, biotehnologia are următoarele avantaje principale:

Posibilitatea de a obține substanțe naturale specifice și unice, dintre care unele (de exemplu, proteine, ADN) nu pot fi încă obținute prin sinteză chimică;

Efectuarea proceselor biotehnologice la temperaturi și presiuni relativ scăzute;

Microorganismele au rate semnificativ mai mari de creștere și acumulare de masă celulară decât alte organisme. De exemplu, cu ajutorul microorganismelor într-un fermentator cu un volum de 300 m 3 pe zi, se poate produce 1 tonă de proteine ​​(365 tone/an). Pentru a produce aceeași cantitate de proteine ​​pe an cu ajutorul vitelor, trebuie să ai o turmă de 30.000 de capete. Dacă totuși, plante leguminoase, precum mazărea, sunt folosite pentru a obține o astfel de rată de producție de proteine, atunci va fi necesar să existe un câmp de mazăre cu o suprafață de 5400 de hectare;

Ca materie primă în procesele biotehnologice, pot fi folosite deșeuri ieftine din agricultură și industrie;

Procesele biotehnologice sunt de obicei mai prietenoase cu mediul decât cele chimice, au deșeuri mai puțin dăunătoare și sunt apropiate de procesele naturale care au loc în natură;

De regulă, tehnologia și echipamentele din industriile biotehnologice sunt mai simple și mai ieftine.

Ca prioritate, biotehnologia se confruntă cu crearea și dezvoltarea producției de medicamente pentru medicină: interferoni, insuline, hormoni, antibiotice, vaccinuri, anticorpi monoclonali și altele, permițând diagnosticarea precoce și tratamentul bolilor cardiovasculare, maligne, ereditare, infecțioase, inclusiv boli virale.

Conceptul de „biotehnologie” este colectiv și acoperă domenii precum tehnologia fermentației, utilizarea biofactorilor folosind microorganisme sau enzime imobilizate, ingineria genetică, tehnologiile imune și proteice, tehnologia care utilizează culturi celulare de origine animală și vegetală.

Biotehnologia este un set de metode tehnologice, inclusiv ingineria genetică, care utilizează organisme vii și procese biologice pentru producerea de medicamente, sau știința dezvoltării și aplicării sistemelor vii, precum și a sistemelor nevii de origine biologică, în cadrul a proceselor tehnologice şi a producţiei industriale.

Biotehnologia modernă este chimia, unde schimbarea și transformarea substanțelor are loc prin procese biologice. În competiție intensă, se dezvoltă cu succes două chimii: sintetică și biologică.

1. Bioobiectele ca mijloc de producere a mijloacelor medicale, de reabilitare, preventive și de diagnosticare. Clasificare și caracteristici generale obiecte biologice.

Obiectele biotehnologiei sunt viruși, bacterii, ciuperci - micromicete și macromicete, organisme protozoare, celule (țesuturi) de plante, animale și oameni, unele substanțe biogene și similare funcțional (de exemplu, enzime, prostaglandine, pectine, acizi nucleici etc. ). În consecință, obiectele biotehnologiei pot fi reprezentate de particule organizate (virusuri), celule (țesuturi) sau metaboliții acestora (primari, secundari). Chiar și atunci când o biomoleculă este utilizată ca obiect al biotehnologiei, biosinteza sa inițială este efectuată în majoritatea cazurilor de celulele corespunzătoare. În acest sens, se poate spune că obiectele biotehnologiei se referă fie la microbi, fie la organisme vegetale și animale. La rândul său, organismul poate fi caracterizat figurativ ca un sistem de producție biochimică economică, complexă, compactă, autoreglabilă și, prin urmare, intenționată, care se desfășoară în mod constant și activ, menținând în același timp toți parametrii necesari. Din această definiție rezultă că virușii nu sunt organisme, dar în funcție de conținutul moleculelor de ereditate, adaptabilitate, variabilitate și alte proprietăți, ei aparțin reprezentanților vieții sălbatice.

După cum se poate observa din diagrama de mai sus, obiectele biotehnologiei sunt extrem de diverse, gama lor se extinde de la particule organizate (viruși) până la oameni.

În prezent, majoritatea obiectelor din biotehnologie sunt microbi aparținând celor trei regate (non-nuclear, pre-nuclear, nuclear) și cinci regate (virusuri, bacterii, ciuperci, plante și animale). Mai mult, primele două regate constau exclusiv din microbi.

Microbii dintre plante sunt algele microscopice (Alge), iar printre animale, protozoarele microscopice (Protozoare). Dintre eucariote, microbii includ ciupercile și, cu anumite rezerve, lichenii, care sunt asociații simbiotice naturale de ciuperci microscopice și microalge sau ciuperci și cianobacterii.

Acaryota - nenuclear, Procaruota - pre-nuclear și Eucaruota - nuclear (din greacă a - nu, pro - to, eu - bun, complet, saruon - miez). Particulele organizate aparțin primului grup - viruși și viroizi, al doilea - bacterii, al treilea - toate celelalte organisme (ciuperci, alge, plante, animale).

Microorganismele formează un număr mare de metaboliți secundari, mulți dintre care și-au găsit, de asemenea, folosință, de exemplu, antibiotice și alți corectori ai homeostaziei celulelor de mamifere.

Probiotice - preparatele bazate pe biomasa anumitor tipuri de microorganisme sunt utilizate pentru disbacterioză pentru a normaliza microflora tractului gastrointestinal. Microorganismele sunt, de asemenea, esențiale în producerea vaccinurilor. În cele din urmă, celulele microbiene pot fi transformate în producători de hormoni proteici specifici speciei pentru om, factori proteici ai imunității nespecifice etc. prin inginerie genetică.

Plantele superioare sunt tradiționale și, până acum, sunt încă cea mai extinsă sursă de medicamente. Atunci când se utilizează plantele ca obiecte biologice, atenția principală se concentrează pe cultivarea țesuturilor vegetale pe medii artificiale (culturi de calus și suspensie) și noile perspective care se deschid în acest caz.

2. Obiecte macrobiologice de origine animală. Omul ca donator și obiect al imunizării. Mamifere, păsări, reptile etc.

LA anul trecutÎn legătură cu dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant, importanța unui astfel de obiect biologic ca persoană crește rapid, deși la prima vedere acest lucru pare paradoxal.

Cu toate acestea, din punct de vedere al biotehnologiei (cu utilizarea bioreactoarelor), o persoană a devenit un obiect biologic numai după realizarea posibilității de a-și clona ADN-ul (mai precis, exonii săi) în celulele microorganismelor. Datorită acestei abordări a fost eliminată lipsa de materii prime pentru obținerea proteinelor umane specifice speciei.

importante în biotehnologie sunt obiecte macro, care includ diverse animale și păsări. În cazul producerii de plasmă imună, persoana acționează și ca obiect de imunizare.

Pentru a obține diferite vaccinuri, organe și țesuturi, inclusiv cele embrionare, ale diferitelor animale și păsări sunt folosite ca obiecte pentru reproducerea virusului: Trebuie remarcat faptul că termenul "donator"în acest caz, este desemnat un obiect biologic care furnizează material pentru procesul de fabricație a unui medicament fără a-i afecta propria viață, iar termenul "donator"- un obiect biologic din care colectarea de material pentru producerea unui medicament este incompatibilă cu continuarea vieții.

Dintre țesuturile fetale, țesuturile fetale de pui sunt cele mai utilizate. De beneficii deosebite sunt embrionii de pui (în funcție de disponibilitate) cu vârsta de zece până la douăsprezece zile, care sunt utilizați în principal pentru reproducerea virusurilor și fabricarea ulterioară a vaccinurilor virale. Embrionii de pui au fost introduși în practica virologică în 1931 de către G. M. Woodroof și E. W. Goodpasture. Astfel de embrioni sunt recomandați și pentru detectarea, identificarea și determinarea dozei infecțioase de virusuri, pentru obținerea preparatelor antigenice utilizate în testele serologice.

Incubat la 38°C ouă de găină ovoskopirovat (translucid), aruncat, „transparente” exemplare nefertilizate și rețin fertilizate, în care vasele de sânge umplute ale membranei corionallantoice și mișcările embrionilor sunt clar vizibile.

Infectarea embrionilor poate fi efectuată manual și automat. Această din urmă metodă este utilizată în producția pe scară largă, de exemplu, a vaccinurilor antigripale. Materialul care conține virus este injectat cu o seringă (baterii de seringi) în diferite părți ale embrionului (embrionilor).

Toate etapele de lucru cu embrioni de pui după ovoscopie sunt efectuate în condiții aseptice. Materialul pentru infecție poate fi o suspensie de țesut cerebral zdrobit (în raport cu virusul rabiei), ficat, splină, rinichi (în raport cu ornitoza chlamydia) etc. Pentru a decontamina materialul viral de bacterii sau pentru a preveni bacteriile acestuia. contaminare, se pot utiliza antibiotice adecvate, de exemplu, penicilină cu unele aminoglicozide de ordinul a 150 UI fiecare la 1 ml dintr-o suspensie de material care conține virus. Pentru a combate infecția fungică a embrionilor, se recomandă utilizarea unor antibiotice poliene (nistatina, amfotericină B) sau derivați individuali de benzimidazol (de exemplu, dactarin etc.).

Cel mai adesea, o suspensie de material viral este injectată în cavitatea alantoică sau, mai rar, pe membrana corional-lantoică într-o cantitate de 0,05-0,1 ml, străpungând învelișul dezinfectat (de exemplu, cu etanol iodat) până la adâncimea calculată. După aceea, gaura este închisă cu parafină topită și embrionii sunt plasați într-un termostat, care menține temperatura optimă pentru reproducerea virusului, de exemplu 36-37,5°C. Durata incubației depinde de tipul și activitatea virusului. De obicei, după 2-4 zile, se poate observa o modificare a membranelor, urmată de moartea embrionilor. Embrionii infectați sunt monitorizați zilnic de 1-2 ori (candescenți, întoarse pe cealaltă parte). Embrionii morți sunt apoi transferați în colecția de material viral. Acolo sunt dezinfectați, lichidul alantoic cu virusul este aspirat și transferat în recipiente sterile. Inactivarea virusului la o anumită temperatură se realizează de obicei folosind formol, fenol sau alte substanțe. Folosind centrifugare de mare viteză sau cromatografie de afinitate (vezi), este posibil să se obțină particule virale foarte purificate.

Materialul viral colectat, care a trecut de controlul corespunzător, este supus liofilizării. Următorii indicatori sunt supuși controlului: sterilitate, inofensivă și activitate specifică. În ceea ce privește sterilitatea, ele înseamnă absența: unui virus viu omolog într-un vaccin ucis, bacterii și ciuperci. La animale se evaluează caracterul inofensiv și activitatea specifică și numai după aceea se permite testarea vaccinului pe voluntari sau voluntari; după de succes aprobare clinică, vaccinul este permis să fie utilizat în practica medicală largă.

Pe embrionii de pui, de exemplu, Trăi vaccin antigripal. Este destinat administrarii intranazale (persoane peste 16 ani si copii intre 3 si 15 ani). Vaccinul este un lichid alantoic uscat luat din embrioni de pui infectați cu virus. Tipul de virus este selectat în funcție de situația epidemiologică și prognozele. Prin urmare, medicamentele pot fi produse ca monovaccin sau divaccin (de exemplu, inclusiv virusurile A2 și B) în fiole cu 20 și 8 doze de vaccinare pentru grupurile de populație adecvate. Masa uscată din fiole are de obicei o culoare galben deschis, care persistă chiar și după dizolvarea conținutului fiolei în apă fiartă, răcită.

Vaccinurile gripale vii pentru adulți și copii sunt, de asemenea, pregătite pentru administrare orală. Astfel de vaccinuri sunt tulpini speciale de vaccin, a căror reproducere a avut loc în 5-15 pasaje (nici mai puțin și nici mai mult) pe cultura țesutului renal al embrionilor de pui. Sunt produse sub formă uscată în flacoane. Când se dizolvă în apă, culoarea se schimbă de la galben deschis la roșcat.

Dintre celelalte vaccinuri virale obținute pe embrioni de pui, se poate numi antioreion, împotriva febrei galbene.

Din alte țesuturi embrionare, sunt utilizați embrioni de șoareci sau alte mamifere, precum și fetuși umani avortați.

Țesuturile transplantabile embrionare sunt disponibile după tratamentul cu tripsină, deoarece o cantitate mare de substanțe intercelulare (inclusiv natura neproteică) nu este încă formată în astfel de țesuturi. Celulele se separă și, după tratamentele necesare, se cultivă în medii speciale în monostrat sau în stare suspendată.

Țesuturile izolate de la animale după naștere sunt clasificate ca matur. Cu cât sunt mai în vârstă, cu atât sunt mai greu de cultivat. Cu toate acestea, după cultivarea cu succes, ele se „aliniază” și diferă puțin de celulele embrionare.

Pe lângă poliomielita, se efectuează profilaxie specifică cu vaccinuri vii pentru rujeolă. Vaccin viu uscat împotriva rujeolei sunt fabricate dintr-o tulpină de vaccin, a cărei reproducere a fost efectuată pe culturi celulare de rinichi de cobai sau fibroblaste de prepeliță japoneze.

3. Bioobiecte de origine vegetală. Plante și culturi sălbatice celule vegetale.

Plantele se caracterizează prin: capacitatea de fotosinteză, prezența celulozei, biosinteza amidonului.

Algele sunt o sursă importantă de diverse polizaharide și alte substanțe biologic active. Se reproduc vegetativ, asexuat și sexual. Întrucât obiectele biologice nu sunt folosite suficient, deși, de exemplu, varecul numit kale de mare este produs de industria din diferite țări. Agar-agar și alginații obținuți din alge sunt bine cunoscute.

Celulele plantelor superioare. Plantele superioare (circa 300.000 de specii) sunt organisme pluricelulare diferențiate, predominant terestre. Dintre toate țesuturile, numai cele meristematice sunt capabile să se divizeze, iar toate celelalte țesuturi se formează pe cheltuiala lor. Acest lucru este important pentru obținerea celulelor, care apoi trebuie incluse în procesul biotehnologic.

Celulele meristeme care persistă în stadiul embrionar de dezvoltare de-a lungul vieții plantei sunt numite inițiale, altele se diferențiază treptat și se transformă în celule din diferite țesuturi permanente - celule finale.

În funcție de topologia plantei, meristemele se împart în apicale, sau apicale (lat. arech - vârf), laterale, sau laterale (din lat. lateralis - lateral) și intermediare, sau intercalare (din lat. Intercalaris - interstițial, inserat). .

Totipotența- aceasta este proprietatea celulelor somatice ale plantelor de a-și realiza pe deplin potențialul de dezvoltare până la formarea unei plante întregi.

Orice tip de planta poate produce, in conditii corespunzatoare, o masa neorganizata de celule in divizare - calus (din lat. calus - porumb), mai ales cu efectul inductor al hormonilor vegetali. Producția în masă de cali cu regenerare suplimentară a lăstarilor este potrivită pentru producția de plante la scară largă. În general, calusul este principalul tip de celule vegetale cultivate pe un mediu nutritiv. Țesutul calus de la orice plantă poate fi recultivat pentru o lungă perioadă de timp. În același timp, plantele originare (inclusiv cele meristematice) se diferențiază și se despecializează, dar sunt induse să se divizeze, formând calusul primar.

Pe lângă creșterea calilor, este posibil să se cultive celule ale unor plante în culturi în suspensie. Protoplastele celulelor vegetale par, de asemenea, a fi obiecte biologice importante. Metodele de obținere a acestora sunt fundamental similare cu metodele de obținere a protoplastelor bacteriene și fungice. Experimentele ulterioare mediate de celule cu acestea sunt tentante în ceea ce privește posibilele rezultate valoroase.

4. Bioobiecte – microorganisme. Principalele grupe de substanțe biologic active obținute.

Obiectele biotehnologiei sunt viruși, bacterii, ciuperci - micromicete și macromicete, organisme protozoare, celule (țesuturi) plante, animale și oameni, unele substanțe biogene și similare funcțional (de exemplu, enzime, prostaglandine, lectine, acizi nucleici etc. ). În consecință, obiectele biotehnologiei pot fi reprezentate de particule organizate (virusuri), celule (țesuturi) sau metaboliții acestora (primari, secundari). Chiar și atunci când o biomoleculă este utilizată ca obiect al biotehnologiei, biosinteza sa inițială este efectuată în majoritatea cazurilor de celulele corespunzătoare. În acest sens, se poate spune că obiectele biotehnologiei se referă fie la microbi, fie la organisme vegetale și animale. La rândul său, organismul poate fi caracterizat figurativ ca un sistem de producție biochimică economică, complexă, compactă, autoreglabilă și, prin urmare, intenționată, care se desfășoară în mod constant și activ, menținând în același timp toți parametrii necesari. Din această definiție rezultă că virușii nu sunt organisme, dar în funcție de conținutul moleculelor de ereditate, adaptabilitate, variabilitate și alte proprietăți, ei aparțin reprezentanților vieții sălbatice.

În prezent, majoritatea obiectelor din biotehnologie sunt microbi aparținând celor trei regate (non-nuclear, pre-nuclear, nuclear) și cinci regate (virusuri, bacterii, ciuperci, plante și animale). Mai mult, primele două regate constau exclusiv din microbi.

Celulele ciupercilor, algelor, plantelor și animalelor au un nucleu real separat de citoplasmă și, prin urmare, sunt denumite eucariote.

5. Bioobiecte - macromolecule cu activitate enzimatică. Utilizare în procese biotehnologice.

LA timpuri recente un grup de preparate enzimatice a primit o nouă direcție de aplicare - aceasta este enzimologia inginerească, care este o secțiune a biotehnologiei în care o enzimă acționează ca un bioobiect.

Organoterapia, adică tratamentul cu organe și preparate din organe, țesuturi și secreții ale animalelor, multă vreme s-a bazat pe empirism profund și idei contradictorii, ocupând un loc proeminent în medicina tuturor timpurilor și popoarelor. Abia în a doua jumătate a secolului al XIX-lea, ca urmare a succeselor obţinute de biologice şi Chimie organica, iar dezvoltarea fiziologiei experimentale, organoterapia devine baza stiintifica. Aceasta este legată de numele fiziologului francez Brown-Séquard. O atenție deosebită a fost atrasă asupra lucrării lui Brown-Sekar asociate cu introducerea în corpul uman a extractelor din testiculele unui taur, care influență pozitivă asupra performanței și bunăstării.

Primele medicamente oficiale (GF VII) au fost epinefrina, insulina, pituitrina, pepsina și pancreatina. Mai târziu, ca urmare a cercetărilor ample efectuate de endocrinologi și farmacologi sovietici, s-a dovedit a fi posibilă extinderea constantă a gamei de preparate oficiale și neoficiale de organe.

Cu toate acestea, unii aminoacizi sunt obținuți prin sinteză chimică, de exemplu, glicina, precum și D-, L-metionina, al cărei izomer D este scăzut toxic, prin urmare, un preparat medical pe bază de metionină conține D- și L- forme, deși medicamentul este utilizat în străinătate în medicină, conținând doar forma L a metioninei. Acolo, amestecul racemic de metionină este separat prin bioconversia formei D în forma L sub influența enzimelor speciale ale celulelor vii ale microorganismelor.

Preparatele enzimatice imobilizate au o serie de avantaje semnificative atunci când sunt utilizate în scopuri aplicate în comparație cu precursorii nativi. În primul rând, un catalizator eterogen poate fi ușor separat de mediul de reacție, ceea ce face posibilă: a) oprirea reacției la momentul potrivit; b) reutilizarea catalizatorului; c) obțineți un produs care nu este contaminat cu enzima. Acesta din urmă este deosebit de important într-o serie de industrii alimentare și farmaceutice.

În al doilea rând, utilizarea catalizatorilor eterogene face posibilă efectuarea continuă a procesului enzimatic, de exemplu, în coloane de curgere, și controlul vitezei reacției catalizate, precum și a randamentului produsului, prin modificarea debitului.

În al treilea rând, imobilizarea sau modificarea enzimei contribuie la o modificare țintită a proprietăților catalizatorului, inclusiv specificitatea acestuia (în special în legătură cu substraturile macromoleculare), dependența activității catalitice de pH, compoziția ionică și alți parametri ai mediului. și, foarte important, stabilitatea acestuia față de diferite tipuri de efecte denaturante. Observăm că o contribuție majoră la dezvoltarea principiilor generale pentru stabilizarea enzimelor au avut-o cercetătorii sovietici.

În al patrulea rând, imobilizarea enzimelor face posibilă reglarea activității lor catalitice prin modificarea proprietăților suportului sub acțiunea unor factori fizici, precum lumina sau sunetul. Pe această bază, sunt creați senzori sensibili la mecano și sunet, amplificatoare de semnal slab și procese fotografice fără argint.

Ca urmare a introducerii unei noi clase de catalizatori bioorganici - enzime imobilizate, s-au deschis noi moduri de dezvoltare, anterior inaccesibile, pentru enzimologia aplicată. Doar enumerarea zonelor în care enzimele imobilizate își găsesc aplicarea ar putea ocupa mult spațiu.

6. Direcții de îmbunătățire a obiectelor biologice prin metode de selecție și mutageneză. Mutageni. Clasificare. Caracteristică. Mecanismul acțiunii lor.

Că mutațiile sunt sursa primară de variabilitate a organismelor, creând baza evoluției. Cu toate acestea, în a doua jumătate a secolului al XIX-lea. pentru microorganisme s-a descoperit o altă sursă de variabilitate – transferul de gene străine – un fel de „ingineria genetică a naturii”.

Multă vreme, conceptul de mutație a fost atribuit doar cromozomilor la procariote și cromozomilor (nucleul) la eucariote. În prezent, pe lângă mutațiile cromozomiale, a apărut și conceptul de mutații citoplasmatice (plasmidă - la procariote, mitocondrială și plasmidă - la eucariote).

Mutațiile pot fi cauzate atât de rearanjarea repliconului (o modificare a numărului și a ordinii genelor din acesta), cât și de modificări în interiorul unei gene individuale.

În raport cu orice obiect biologic, dar mai ales adesea în cazul microorganismelor, sunt detectate așa-numitele mutații spontane, care se găsesc într-o populație de celule fără un efect special asupra acesteia.

În funcție de severitatea aproape oricărei trăsături, celulele dintr-o populație microbiană formează o serie de variații. Majoritatea celulelor au o severitate medie a trăsăturii. Abaterile „+” și „-” de la valoarea medie se găsesc în populație cu cât mai rar, cu atât abaterea în orice direcție este mai mare (Fig. I). Abordarea inițială, cea mai simplă a îmbunătățirii unui obiect biologic a constat în selectarea abaterilor „+” (presupunând că aceste abateri corespund intereselor producției). Într-o clonă nouă (descendență omogenă genetic a unei celule; pe un mediu solid - o colonie), obținută dintr-o celulă cu o abatere „+”, selecția a fost din nou efectuată conform aceluiași principiu. Cu toate acestea, o astfel de procedură, atunci când este repetată de mai multe ori, își pierde destul de repede eficacitatea, adică abaterile „+” devin mai mici în amploare în clonele noi.

Mutageneza este efectuată atunci când un obiect biologic este tratat cu mutageni fizici sau chimici. În primul caz, de regulă, acestea sunt ultraviolete, gamma, raze X; în al doilea - nitrometiluree, nitrozoguanidină, coloranți de acridină, unele substanțe naturale (de exemplu, din antibiotice ADN-tropice din cauza toxicității lor neutilizate în clinica bolilor infecțioase). Mecanismul de activitate al mutagenilor fizici și chimici este asociat cu acțiunea lor directă asupra ADN-ului (în primul rând asupra bazelor azotate ale ADN-ului, care se exprimă prin reticulare, dimerizare, alchilare a acestora din urmă și intercalare între ele).

Se înțelege, desigur, că prejudiciul nu duce la moarte. Astfel, după tratarea unui obiect biologic cu agenți mutageni (fizici sau chimici), efectul acestora asupra ADN-ului duce la frecvente modificări ereditare deja la nivelul fenotipului (una sau alta dintre proprietățile sale). Următoarea sarcină este de a selecta și evalua exact mutațiile de care are nevoie biotehnologul. Pentru identificarea acestora, cultura tratată este însămânțată pe medii nutritive solide de diferite compoziții, după diluarea acesteia în așa fel încât să nu existe o creștere continuă pe mediul solid, ci se formează colonii separate, formate în timpul reproducerii doar a celulelor individuale. Apoi fiecare colonie este reînsămânțată și cultura rezultată (clona) este verificată pentru una sau alta caracteristică în comparație cu cea originală. Această parte de selecție a lucrării în ansamblu este foarte laborioasă, deși tehnicile care fac posibilă creșterea eficienței acesteia sunt în mod constant îmbunătățite.

Astfel, prin modificarea compoziției mediilor nutritive solide pe care cresc coloniile, se pot obține imediat informații inițiale despre proprietățile celulelor acestei colonii în comparație cu celulele culturii originale. Pentru a semăna clone cu diferite caracteristici metabolice, se folosește așa-numita „metodă amprentă” dezvoltată de J. Lederberg și E. Lederberg. Populația de celule microbiene este crescută astfel încât aproximativ o sută de colonii să crească pe o placă Petri cu un mediu nutritiv și să fie clar separate. Catifea este pusă pe un cilindru metalic cu un diametru apropiat de diametrul unei cutii Petri; apoi totul este sterilizat, creând astfel un „fund steril de catifea” al cilindrului. Apoi, acest fund este aplicat pe suprafața mediului într-o cană cu colonii crescute pe ea. În acest caz, coloniile par să fie „întipărite” pe catifea. Apoi, această catifea este aplicată pe suprafața mediilor de compoziție diferită. Astfel, se poate stabili: care dintre coloniile din vasul original (locația coloniilor pe catifea reflectă locația lor pe suprafața mediului solid din vasul original) corespunde, de exemplu, unui mutant care are nevoie de o anumită vitamină sau un anume aminoacid; sau ce colonie este compusă din celule mutante capabile să formeze o enzimă care oxidează un anumit substrat; sau care colonie este formată din celule care au dobândit rezistență la un anumit antibiotic etc.

În primul rând, biotehnologul este interesat de culturile mutante care au o capacitate crescută de a forma produsul țintă. Producătorul substanței țintă, cel mai promițător din punct de vedere practic, poate fi tratat în mod repetat cu diferiți mutageni. Noi tulpini mutante obținute în laboratoare științifice tari diferite ale lumii, servesc ca subiect de schimb în colaborare creativă, vânzare de licențe etc.

Posibilitățile potențiale de mutageneză (cu selecția ulterioară) se datorează dependenței biosintezei produsului țintă de multe procese metabolice din organismul producătorului. De exemplu, activitate crescută a unui organism care formează produsul țintă poate fi de așteptat dacă mutația a condus la duplicarea (dublarea) sau amplificarea (multiplicarea) genelor structurale incluse în sistemul de sinteză a produsului țintă. Mai mult, activitatea poate fi crescută dacă, datorită diferitelor tipuri de mutații, funcțiile genelor represoare care reglează sinteza produsului țintă sunt suprimate. O modalitate foarte eficientă de a crește formarea produsului țintă este o încălcare a sistemului de retroinhibare. De asemenea, este posibilă creșterea activității producătorului prin modificarea (datorită mutațiilor) a sistemului de transport al precursorilor produsului țintă în celulă. În cele din urmă, uneori produsul țintă, cu o creștere bruscă a formării sale, afectează negativ viabilitatea propriului producător (așa-numitul efect suicidar). Creșterea rezistenței unui producător la propria substanță este adesea necesară pentru a obține, de exemplu, superproducători de antibiotice.

Pe lângă duplicarea și amplificarea genelor structurale, mutațiile pot fi de natura unei ștergeri - „ștergere”, adică. pierderea unei părți a materialului genetic. Mutațiile pot fi cauzate de transpunere (inserarea unui segment al unui cromozom într-o nouă locație) sau inversare (modificarea ordinii genelor de pe un cromozom). În acest caz, genomul organismului mutant suferă modificări care duc în unele cazuri la pierderea unei anumite trăsături de către mutant, iar în altele la apariția unei noi trăsături în acesta. Genele din locuri noi sunt sub controlul altor sisteme de reglementare. În plus, proteinele hibride neobișnuite pentru organismul original pot apărea în celulele mutante datorită faptului că un promotor controlează lanțurile polinucleotidice a două (sau mai multe) gene structurale care anterior erau îndepărtate una de cealaltă.

Așa-numitele mutații „punctuale” pot avea, de asemenea, o importanță considerabilă pentru producția biotehnologică. În acest caz, modificările apar în cadrul unei singure gene. De exemplu, ștergerea sau inserarea uneia sau mai multor baze.Mutațiile „punctuale” includ transversia (când o purină este înlocuită cu o pirimidină) și tranziția (înlocuirea unei purine cu o altă purină sau a unei pirimidine cu o altă pirimidină). Substituțiile într-o pereche de nucleotide (substituții minime) în timpul transferului codului genetic în etapa de translație duc la apariția în proteina codificată a unui alt aminoacid în loc de unul. Acest lucru poate schimba drastic conformația unei anumite proteine ​​și, în consecință, activitatea ei funcțională, mai ales în cazul înlocuirii unui rest de aminoacizi în centrul activ sau alosteric.

Unul dintre cele mai strălucitoare exemple de eficacitate a mutagenezei urmată de selecția bazată pe o creștere a formării produsului țintă este istoria creării superproducătorilor moderni de penicilină. Lucrările cu obiectele biologice inițiale - tulpini (o tulpină este o cultură de clonă, a cărei omogenitate în funcție de anumite caracteristici este menținută prin selecție) ale ciupercii Penicillium chrysogenum, izolată din surse naturale, se desfășoară încă din anii 1940. de câteva decenii în multe laboratoare. Inițial, s-a obținut un oarecare succes în selecția mutanților care rezultă din mutații spontane. Apoi am trecut la inducerea mutațiilor de către mutageni fizici și chimici. Ca urmare a unui număr de mutații de succes și a selecției treptate a mutanților din ce în ce mai productivi, activitatea tulpinilor de Penicillium chrysogenum utilizate în industria țărilor în care se produce penicilina este acum de 100 de mii de ori mai mare decât cea a tulpinii originale descoperite de A. Fleming, de la care a început istoria descoperirii penicilinei.

Tulpinile de producție (în legătură cu producția biotehnologică) cu o productivitate atât de mare (acest lucru se aplică nu numai penicilinei, ci și altor produse țintă) sunt extrem de instabile datorită faptului că numeroasele modificări artificiale în genomul celulelor tulpinilor nu sunt de sine stătătoare. semnificaţie pozitivă pentru viabilitatea acestor celule.au. Prin urmare, tulpinile mutante necesită monitorizare constantă în timpul depozitării: populația de celule este însămânțată pe un mediu solid și culturile obținute din colonii individuale sunt testate pentru productivitate. În acest caz, revertanții - culturile cu activitate redusă sunt aruncate. Reversia este explicată prin mutații spontane inverse care conduc la revenirea unei secțiuni a genomului (un fragment specific de ADN) la starea sa originală. Sistemele speciale de reparare enzimatică sunt implicate în revenirea la normă - în mecanismul evolutiv de menținere a constanței speciei.

Îmbunătățirea obiectelor biologice în raport cu producția nu se limitează la creșterea productivității acestora. Deși această direcție este, fără îndoială, cea principală, nu poate fi singura: funcționarea cu succes a producției biotehnologice este determinată de mulți factori. Din punct de vedere economic, este foarte important să se obțină mutanți capabili să utilizeze medii nutritive mai ieftine și mai puțin deficitare. Dacă mediile scumpe nu creează speciale probleme financiare, apoi în producția pe scară largă, reducerea costului acestora (deși fără creșterea nivelului de activitate al producătorului) este extrem de importantă.

Un alt exemplu: în cazul unor obiecte biologice, lichidul de cultură după terminarea fermentației are proprietăți reologice nefavorabile din punct de vedere tehnologic. Prin urmare, în magazinul pentru izolarea și purificarea produsului țintă, lucrând cu un lichid de cultură cu vâscozitate crescută, ei întâmpină dificultăți atunci când folosesc separatoare, filtre prese etc. Mutațiile care modifică metabolismul unui obiect biologic într-un mod corespunzător înlătură aceste dificultăți în mare măsură.

Producția de obiecte biologice rezistente la fagi este de mare importanță în ceea ce privește garantarea fiabilității producției. Respectarea condițiilor aseptice în timpul fermentației se referă în primul rând la prevenirea pătrunderii celulelor și sporilor bacteriilor și fibrelor străine (în cazuri mai rare, alge și protozoare) în inocul (precum și în aparatul de fermentație). Este extrem de dificil să previi intrarea fagilor în fermentator împreună cu aerul de proces sterilizat prin filtrare. Nu întâmplător, virușii în primii ani după descoperirea lor au fost numiți „filtrabili”. Prin urmare, principala modalitate de a combate bacteriofagii, actinofagii și fagii care infectează ciupercile este obținerea de forme mutante de obiecte biologice care sunt rezistente la acestea.

Fără a atinge cazurile speciale de lucru cu obiecte biologice-patogeni, trebuie subliniat că uneori sarcina de a îmbunătăți obiectele biologice vine din cerințele de igiena industrială. De exemplu, un producător al unuia dintre antibioticele importante beta-lactamice, izolat dintr-o sursă naturală, a format o cantitate semnificativă de substanțe volatile cu un miros neplăcut de legume putrezite.

Mutații care conduc la ștergerea genelor care codifică enzimele implicate în sinteza acestor substanțe volatile dobândite în acest caz valoare practică pentru producție.

Din cele de mai sus rezultă că un obiect biologic modern utilizat în industria biotehnologică este un super-producător care diferă de tulpina naturală originală nu într-un singur indicator, ci, de regulă, în mai mulți indicatori. Depozitarea unor astfel de tulpini-superproducători este o problemă independentă serioasă. Cu toate metodele de depozitare, acestea trebuie să fie periodic reînsămânțate și verificate atât pentru productivitate, cât și pentru alte proprietăți importante pentru producție.

În cazul utilizării plantelor și animalelor superioare ca obiecte biologice pentru obținerea medicamentelor, posibilitățile de utilizare a mutagenezei și selecției pentru îmbunătățirea lor sunt limitate. Cu toate acestea, în principiu, mutageneza și selecția nu sunt excluse aici. Acest lucru este valabil mai ales pentru plantele care formează metaboliți secundari care sunt utilizați ca substanțe medicinale.

7. Direcții pentru crearea de noi obiecte biologice prin metode de inginerie genetică. Niveluri de bază ale ingineriei genetice. Caracteristică.

Cu ajutorul metodelor de inginerie genetică este posibilă proiectarea, după un anumit plan, a unor noi forme de microorganisme capabile să sintetizeze o mare varietate de produse, inclusiv produse de origine animală și vegetală.Totodată, trebuie luate în considerare țin cont de ratele ridicate de creștere și productivitatea microorganismelor, de capacitatea acestora de a utiliza diferite tipuri de materii prime. Posibilitatea sintezei microbiologice a proteinelor umane deschide perspective largi pentru biotehnologie: se obțin astfel somatostatina, interferonii, insulina și hormonul de creștere.

Principalele probleme în calea construirii de noi producători de microorganisme sunt următoarele.

1. Produsele genice de origine vegetală, animală și umană intră într-un mediu intracelular străin lor, unde sunt distruse de proteazele microbiene. Peptidele scurte precum somatostatina sunt hidrolizate deosebit de rapid, în câteva minute. Strategia de protejare a proteinelor modificate genetic într-o celulă microbiană se reduce la: a) utilizarea inhibitorilor de protează; Astfel, randamentul de interferon uman a crescut de 4 ori atunci când un fragment de ADN al fagului T4 cu gena a fost introdus în plasmida care poartă gena interferonului. pin, responsabil pentru sinteza unui inhibitor de protează; b) obţinerea unei peptide de interes ca parte a unei molecule de proteine ​​hibride, pentru aceasta, gena peptidei este fuzionată cu gena naturală a organismului receptor; cea mai frecvent utilizată genă proteică este A Staphylococcus aureus c) amplificarea (creșterea numărului de copii) genelor; repetarea repetată a genei proinsulinei umane în plasmidă a condus la sinteza în celulă E coli un multimer al acestei proteine, care s-a dovedit a fi mult mai stabil la acțiunea proteazelor intracelulare decât proinsulina monomerică. Problema stabilizării proteinelor străine în celule nu a fost încă suficient studiată (V.I. Tanyashin, 1985).

2. În cele mai multe cazuri, produsul genei transplantate nu este eliberat în mediul de cultură și se acumulează în interiorul celulei, ceea ce complică semnificativ izolarea acesteia. Astfel, metoda acceptată de obținere a insulinei utilizând E coli implică distrugerea celulelor și purificarea ulterioară a insulinei. În acest sens, o mare importanță se acordă transplantului de gene responsabile de excreția proteinelor din celule. Există informații despre o nouă metodă de sinteză modificată genetic a insulinei, care este eliberată în mediul de cultură (M. Sun, 1983).

Reorientarea biotehnologilor de la obiectul lor preferat de inginerie genetică este, de asemenea, justificată. E coli la alte obiecte biologice. E coli excretă relativ puține proteine. În plus, peretele celular al acestei bacterii conține substanța toxică endocotină, care trebuie separată cu grijă de produsele utilizate în scop farmacologic. Deoarece obiectele ingineriei genetice sunt promițătoare, bacteriile gram-pozitive (reprezentanți ai genurilor Bacil, Staphylococcus, Streptomyces).În special Bas. subtilis eliberează mai mult de 50 de proteine ​​diferite în mediul de cultură (C. Vard, 1984). Acestea includ enzime, insecticide și antibiotice. Organismele eucariote sunt de asemenea promițătoare. Au o serie de avantaje, în special, interferonul de drojdie este sintetizat într-o formă glicozilată, ca proteina umană nativă (spre deosebire de interferonul sintetizat în celule). E. coti).

3. Cele mai multe trăsături ereditare sunt codificate de mai multe gene, iar dezvoltarea ingineriei genetice ar trebui să includă etapele transplantului secvenţial al fiecăreia dintre gene. Un exemplu de proiect multigen implementat este crearea unei tulpini Pseudomonas sp., capabile să utilizeze țiței. Cu ajutorul plasmidelor, tulpina a fost îmbogățită succesiv în gene pentru enzime care degradează octanul, camforul, xilenul și naftalina (V. G. Debabov, 1982). În unele cazuri, este posibilă transplantarea nu secvenţială, ci simultană a blocurilor întregi de gene folosind o singură plasmidă. Ca parte a unei plasmide, operonul nif poate fi transferat în celula primitoare pneumonie Klebsiella, responsabil de fixarea azotului. Capacitatea organismului de a fixa azotul este determinată de prezența a cel puțin 17 gene diferite responsabile atât de componentele structurale ale complexului de nitrogenază, cât și de reglarea sintezei acestora.

Ingineria genetică a plantelor se realizează la nivel organic, tisular și celular. Demonstrată, deși pentru câteva specii (roșii, tutun, lucernă), posibilitatea regenerării întregului organism dintr-o singură celulă a crescut semnificativ interesul pentru ingineria genetică a plantelor. Cu toate acestea, aici, pe lângă problemele pur tehnice, este necesar să se rezolve problemele asociate cu încălcările structurii genomului (modificări ale ploidiei, rearanjamente cromozomiale) celulelor plantelor cultivate. Un exemplu de proiect de inginerie genetică implementat este sinteza phaseolinei, o proteină de depozitare a fasolei, în plantele de tutun regenerate. Transplantul genei responsabile pentru sinteza fazolinei a fost efectuat folosind o plasmidă Ti ca vector. Cu ajutorul Ti-plasmidei a fost transplantată și gena de rezistență la antibioticul neomicină în plante de tutun, iar cu ajutorul virusului CMV, gena de rezistență la metotrexat, inhibitor de dihidrofolat reductază, a fost transplantată în plante de nap.

Ingineria genetică a plantelor include manipulări nu numai cu genomul nuclear al celulelor, ci și cu genomul cloroplastelor și mitocondriilor. În genomul cloroplastului este cel mai oportun să se introducă gena de fixare a azotului pentru a elimina nevoia plantei de îngrășăminte cu azot. Două plasmide (S-1 și S-2) au fost găsite în mitocondriile de porumb, care determină sterilitatea masculină citoplasmatică. Dacă crescătorii trebuie să „interzice” autopolenizarea porumbului și să permită doar polenizarea încrucișată, s-ar putea să nu le pese să îndepărteze manual staminele dacă iau plante cu sterilitate masculină citoplasmatică pentru fertilizare. Astfel de plante pot fi crescute prin selecție pe termen lung, dar ingineria genetică oferă o metodă mai rapidă și mai direcționată - introducerea directă a plasmidelor în mitocondriile celulelor de porumb. Evoluțiile în domeniul ingineriei genetice a plantelor ar trebui să includă și modificarea genetică a simbioților plantelor - bacterii nodulare ale genului Rhizobium. Este planificată introducerea în celulele acestor bacterii folosind plasmide hup(absorbție de hidrogen) - o genă care există în natură numai în unele tulpini de R. japonicumși R. leguminosarum. Nir-gen determină absorbția și utilizarea hidrogenului gazos eliberat în timpul funcționării complexului de enzime fixatoare de azot al bacteriilor nodulare. Reciclarea hidrogenului face posibilă evitarea pierderii echivalenților reducători în timpul fixării simbiotice a azotului în nodulii plantelor leguminoase și creșterea semnificativă a productivității acestor plante.

Aplicarea metodelor de inginerie genetică pentru a îmbunătăți rasele de animale de fermă rămâne o sarcină îndepărtată. Vorbim despre creșterea eficienței utilizării furajelor, creșterea fertilității, a producției de lapte și ouă, rezistența animalelor la boli, accelerarea creșterii acestora și îmbunătățirea calității cărnii. Cu toate acestea, genetica tuturor acestor trăsături ale animalelor de fermă nu a fost încă elucidată, ceea ce împiedică încercările de manipulare genetică în acest domeniu.

8. Ingineria celulară și utilizarea acesteia în crearea de microorganisme și celule vegetale. Metoda fuziunii protoplastelor.

Ingineria celulară este unul dintre cele mai importante domenii din biotehnologie. Se bazează pe utilizarea unui obiect fundamental nou - o cultură izolată de celule sau țesuturi ale organismelor eucariote, precum și pe totipotența - o proprietate unică a celulelor vegetale. Utilizarea acestui obiect a deschis mari oportunități în rezolvarea problemelor teoretice și practice globale. În zona stiinte fundamentale a devenit fezabilă studierea unor astfel de probleme complexe precum interacțiunea celulelor în țesuturi, diferențierea celulelor, morfogeneza, realizarea totipotenței celulare, mecanismele de apariție a celulelor canceroase etc., în special, medicamente mai ieftine, precum și cultivarea de plante sănătoase fără virusuri, înmulțirea lor clonală etc.

În 1955, după descoperirea de către F. Skoog și S. Miller a unei noi clase de fitohormoni - citokinine - s-a dovedit că acțiunea lor combinată cu o altă clasă de fitohormoni - auxine - a făcut posibilă stimularea diviziunii celulare, susținerea creșterii țesutul calus și induc morfogeneza în condiții controlate.

În 1959, a fost propusă o metodă pentru creșterea unor mase mari de suspensii celulare. Un eveniment important a fost dezvoltarea de către E. Cocking (Universitatea din Nottingham, Marea Britanie) în 1960 a unei metode de obținere a protoplastelor izolate. Acesta a fost impulsul pentru producerea de hibrizi somatici, introducerea de ARN viral, organele celulare și celule procariote în protoplaste. În același timp, J. Morel și R. G. Butenko au propus metoda de micropropagare clonală, care a găsit imediat o largă aplicație practică. O realizare foarte importantă în dezvoltarea tehnologiilor de cultivare a țesuturilor și celulelor izolate a fost cultivarea unei singure celule cu ajutorul unui țesut „dădacă”. Această metodă a fost dezvoltată în Rusia în 1969 la Institutul de Fiziologie a Plantelor. K. A. Timiryazev RAS sub conducerea lui R. G. Butenko. În ultimele decenii, progresul rapid al tehnologiilor de inginerie celulară a continuat, făcând posibilă facilitarea semnificativă a activității de reproducere. S-a obținut un mare succes în dezvoltarea metodelor de obținere a plantelor transgenice, a tehnologiilor de utilizare a țesuturilor izolate și a celulelor plantelor erbacee, iar cultivarea țesuturilor plantelor lemnoase a început.

Termenul de „protoplaste izolate” a fost propus pentru prima dată de D. Hunstein în 1880. Protoplasta din întreaga celulă poate fi observată în timpul plasmolizei. Un protoplast izolat este conținutul unei celule vegetale înconjurat de o plasmălemă. Peretele de celuloză această educație dispărut. Protoplastele izolate sunt unul dintre cele mai valoroase obiecte din biotehnologie. Ele fac posibilă studierea diferitelor proprietăți ale membranelor, precum și transportul substanțelor prin plasmalemă. Principalul lor avantaj este că este destul de ușor să introduceți informații genetice din organele și celulele altor plante, organisme procariote și celule animale în protoplaste izolate. E. Cocking a descoperit că un protoplast izolat, datorită mecanismului de pinocitoză, este capabil să absoarbă din mediu inconjurator nu numai substanțe cu greutate moleculară mică, ci și molecule mari, particule (virusuri) și chiar organele izolate.

De mare importanță în crearea de noi forme de plante pentru studiul interacțiunii genomului nuclear și a genomilor de organele este capacitatea protoplastelor izolate de a fuziona, formând celule hibride. În acest fel, se pot obține hibrizi din plante cu diferite grade de îndepărtare taxonomică, dar cu calități economice valoroase.

Pentru prima dată, protoplastele au fost izolate de J. Klerner în 1892 în timp ce studia plasmoliza în celulele frunzei de teloreza. (Strtiotes aloides)în timpul leziunilor mecanice ale țesuturilor. Prin urmare, această metodă se numește mecanică. Vă permite să izolați doar un număr mic de protoplaste (excreția nu este posibilă din toate tipurile de țesuturi); metoda în sine este lungă și laborioasă. Metoda modernă de izolare a protoplastelor este îndepărtarea peretelui celular folosindu-se treptat de enzime pentru distrugerea acestuia: celulază, hemicelulază, pectinază. Această metodă se numește enzimatică.

Prima izolare reușită a protoplastelor din celulele plantelor superioare prin această metodă a fost realizată de E. Kokking în 1960. În comparație cu metoda mecanică, metoda enzimatică are o serie de avantaje. Face posibilă izolarea relativ ușor și rapidă a unui număr mare de protoplaste, iar acestea nu suferă un șoc osmotic puternic. După acțiunea enzimelor, amestecul de protoplaste este trecut printr-un filtru și centrifugat pentru a îndepărta celulele intacte și fragmentele acestora.

Protoplastele pot fi izolate din celule de țesut vegetal, din cultura calusului și din cultura în suspensie. Condițiile optime pentru izolarea protoplastelor pentru diferite obiecte sunt individuale, ceea ce necesită o muncă preliminară minuțioasă privind selecția concentrațiilor de enzime, raportul acestora și timpul de procesare. Foarte un factor important selectarea unui stabilizator osmotic este cheia pentru izolarea protoplastelor viabile întregi. Ca stabilizatori se folosesc de obicei diferite zaharuri, uneori agenți osmotici ionici (soluții de CaCl 2, Na 2 HP0 4, săruri KSI). Concentrația agenților osmotici trebuie să fie ușor hipertonică pentru ca protoplastele să fie într-o stare de plasmoliză ușoară. În acest caz, metabolismul și regenerarea peretelui celular sunt inhibate.

Protoplastele izolate pot fi cultivate. De obicei, pentru aceasta se folosesc aceleași medii, pe care cresc celule și țesuturi izolate. Imediat după îndepărtarea enzimelor, începe formarea peretelui celular în protoplastele aflate în cultură. Protoplastul care a regenerat peretele se comportă ca o celulă izolată și este capabil să se dividă și să formeze o clonă de celule. Regenerarea plantelor întregi din protoplaste izolate este asociată cu o serie de dificultăți. Regenerarea prin embriogeneză a fost realizată până acum doar la plantele de morcov. Prin stimularea formării succesive a rădăcinilor și lăstarilor (organogeneza), s-a realizat regenerarea tutunului, petuniei și a altor plante. Trebuie remarcat faptul că protoplastele izolate dintr-o cultură celulară stabilă genetic regenerează mai des plantele și sunt utilizate cu mare succes în studiile modificării genetice a protoplastelor.

9. Metode de inginerie celulară aplicate celulelor animale. Tehnologia hibridomului și utilizarea sa în procesele biotehnologice.

În 1975, G. Köhler și K. Milstein au reușit pentru prima dată să izoleze clone celulare capabile să secrete un singur tip de moleculă de anticorpi și în același timp să crească în cultură. Aceste clone celulare au fost obținute prin fuziunea celulelor formatoare de anticorpi și a celulelor tumorale - celule himerice, numite hibridoame, deoarece, pe de o parte, au moștenit capacitatea de a crește aproape nelimitat în cultură și, pe de altă parte, capacitatea de a produce anticorpi cu o anumită specificitate (anticorpi monoclonali) .

Este foarte important pentru un biotehnolog ca clonele selectate să poată fi păstrate congelate pentru o perioadă lungă de timp; prin urmare, dacă este necesar, o anumită doză dintr-o astfel de clonă poate fi luată și injectată într-un animal care va dezvolta o tumoră producătoare de anticorpi monoclonali ai unui anumit specificitate. Anticorpii vor fi detectați în curând în serul animalului la o concentrație foarte mare de 10 până la 30 mg/ml. Celulele unei astfel de clone pot fi, de asemenea, crescute in vitro, iar anticorpii pe care îi secretă pot fi obținuți din fluidul de cultură.

Crearea hibridoamelor care pot fi păstrate congelate (crioconservare) a făcut posibilă organizarea unor bănci întregi de hibridoame, care, la rândul lor, au deschis perspective mari pentru utilizarea anticorpilor monoclonali. Domeniul de aplicare a acestora, pe lângă determinarea cantitativă a diferitelor substanțe, include o mare varietate de diagnostice, de exemplu, identificarea unui anumit hormon, antigene virale sau bacteriene, antigene de grup sanguin și antigene tisulare.

Etape de obținere a celulelor hibride. Fuziunea celulară este precedată de stabilirea unui contact strâns între membranele plasmatice. Acest lucru este prevenit prin prezența unei sarcini de suprafață pe membranele naturale datorită grupurilor de proteine ​​și lipide încărcate negativ. Depolarizarea membranelor printr-un câmp electric sau magnetic alternant, neutralizarea sarcinii negative a membranelor cu ajutorul cationilor favorizează fuziunea celulară. În practică, ionii de Ca2+ și clorpromazina sunt utilizați pe scară largă. Un agent eficient de „drenare” (fusogenic) este polietilenglicolul.

În legătură cu celulele animale, este utilizat și virusul Sendai, a cărui acțiune ca agent confluent, aparent, este asociată cu hidroliza parțială a proteinelor membranei citoplasmatice. Regiunea subunității FI a virusului are activitate proteolitică (C. Nicolau și colab., 1984). Celulele vegetale, fungice și bacteriene sunt eliberate de peretele celular înainte de fuziune și se obțin protoplaste. Peretele celular este supus hidrolizei enzimatice folosind lizozima (pentru celulele bacteriene), zimoliaza de melc (pentru celulele fungice), un complex de celulaze, hemicelulaze si pectinaze produse de ciuperci (pentru celulele vegetale). Umflarea și distrugerea ulterioară a protoplastelor este prevenită prin crearea unei osmolarități crescute a mediului. Selectarea enzimelor hidrolitice și concentrarea sărurilor în mediu pentru a asigura randamentul maxim de protoplaste este o sarcină complexă, care se rezolvă în fiecare caz separat.

Pentru screeningul celulelor hibride obţinute sunt utilizate diverse abordări: 1) luarea în considerare a trăsăturilor fenotipice; 2) crearea unor condiții selective în care supraviețuiesc doar hibrizii care au combinat genomul celulelor parentale.

Posibilitățile metodei fuziunii celulare. Metoda de fuziune a celulelor somatice deschide perspective semnificative pentru biotehnologie.

1. Posibilitatea încrucișării unor forme de viață îndepărtate filogenetic. Prin fuziunea celulelor vegetale s-au obținut hibrizi interspecifici fertili, fenotipic normali de tutun, cartofi, varză cu napi (echivalent cu rapiță naturală), petunii. Există hibrizi intergeneri sterili de cartof și roșii, hibrizi intertribali sterili de Arabidopsis și nap, tutun și cartofi, tutun și belladona, care formează tulpini și plante anormale din punct de vedere morfologic. Hibrizii celulari au fost obținuți între reprezentanți ai diferitelor familii, existând, însă, doar ca celule de creștere neorganizate (tutun și mazăre, tutun și soia, tutun și fasole de cal). S-au obținut hibrizi de drojdie interspecifici (Saccharomyces uvarum și S. diastalicus) și intergeneri (Kluyveromyces lactis și S. cerevisiae). Există dovezi ale fuziunii celulelor diferitelor tipuri de ciuperci și bacterii.

Oarecum curioase sunt experimentele privind fuziunea celulelor organismelor aparținând unor regate diferite, de exemplu, celulele broaștelor Xenopus taevis și protoplastele de morcov. O celulă hibridă plantă-animal este îmbrăcată treptat cu un perete celular și crește pe mediul pe care sunt cultivate celulele vegetale. Nucleul unei celule animale, aparent, își pierde rapid activitatea (E. S. Cocking, 1984).

2. Obținerea hibrizilor asimetrici care poartă setul complet de gene al unuia dintre părinți și un set parțial al celuilalt părinte. Astfel de hibrizi apar adesea din fuziunea celulelor organismelor care sunt îndepărtate filogenetic unele de altele. În acest caz, din cauza diviziunilor celulare anormale din cauza comportamentului necoordonat a două seturi eterogene de cromozomi, într-o serie de generații, cromozomii unuia dintre părinți se pierd parțial sau complet.

Hibrizii asimetrici sunt mai stabili, mai prolifici și mai viabili decât hibrizii simetrici care poartă seturile complete de gene ale celulelor părinte. În scopul hibridizării asimetrice, este posibil să se trateze selectiv celulele unuia dintre părinți pentru a distruge o parte din cromozomii acestuia. Este posibil transferul direcționat de la celulă la celulă al cromozomului dorit. De asemenea, este de interes să se obțină celule în care doar citoplasma este hibridă. Hibrizii citoplasmatici se formează atunci când, după fuziunea celulară, nucleii își păstrează autonomia și, în timpul divizării ulterioare a celulei hibride, ajung în diferite celule fiice. Screening-ul unor astfel de celule este realizat de gene marker ale genomului nuclear și citoplasmatic (mitocondrial și cloroplastic).

Celulele cu citoplasmă fuzionată (dar nu nuclee) conțin genomul nuclear al unuia dintre părinți și, în același timp, combină genele citoplasmatice ale celulelor fuzionate. Există indicii ale recombinării ADN-ului mitocondrial și cloroplastic în celulele hibride.

Obținerea hibrizilor prin fuzionarea a trei sau mai multe celule parentale. Din astfel de celule hibride pot fi cultivate plante regenerate (ciuperci).

Hibridizarea celulelor care poartă diferite programe de dezvoltare - fuziunea celulelor diferitelor țesuturi sau organe, fuziunea celulelor normale cu celule al căror program de dezvoltare a fost modificat ca urmare a degenerescenței maligne. În acest caz, se obțin așa-numitele celule hibridom, sau hibridoame, moștenind de la o celulă părinte normală capacitatea de a sintetiza unul sau altul compus util, iar de la unul malign - capacitatea de creștere rapidă și nelimitată.

tehnologie hibridă. Până în prezent, obținerea hibridoamelor este cea mai promițătoare direcție în ingineria celulară. Scopul principal este de a „imortiza” o celulă care produce substanțe valoroase prin fuziunea cu o celulă canceroasă și clonarea liniei de celule hibridom rezultate. Hibridoamele se obțin pe baza celulelor - reprezentanți ai diferitelor regate ale vieții. Fuziunea celulelor vegetale care de obicei cresc lent în cultură cu celule tumorale vegetale face posibilă obținerea de clone de celule cu creștere rapidă producând compușii doriti. Aplicațiile tehnologiei hibridomului la celulele animale sunt multiple, unde se plănuiește obținerea de producători cu reproducere nelimitată de hormoni și factori proteici din sânge cu ajutorul acestuia Hibridoamele sunt de cea mai mare importanță practică - produse ale fuziunii celulelor tumorilor maligne ale sistemului imunitar. sistem (mieloame) cu celule normale din același sistem – limfocite.

Când un agent străin (bacterii, viruși, celule „străine” sau pur și simplu compuși organici complecși) intră în corpul unui animal sau al unei persoane, limfocitele sunt mobilizate pentru a neutraliza agentul introdus. Există mai multe populații de limfocite cu funcții diferite. Există așa-numitele limfocite T, printre care se numără T-killers („killers”), care atacă direct un agent străin pentru a-l inactiva și limfocitele B, a căror funcție principală este de a produce proteine ​​imune (imunoglobuline) care neutralizează un agent străin prin legarea cu suprafețele sale (determinanți antigenici), cu alte cuvinte, limfocitele B produc proteine ​​imune care sunt anticorpi la un agent străin - un antigen.

Fuziunea unui limfocit T ucigaș cu o celulă tumorală produce o clonă de celule cu reproducere nelimitată care urmăresc un anumit antigen - cel pentru care limfocitul T luat a fost specific. Astfel de clone de hibridom T-killer încearcă să fie folosite pentru a lupta împotriva celulelor canceroase direct în corpul pacientului (B. Fuchs și colab., 1981; 1983),

Când un limfocit B fuzionează cu o celulă de mielom, se obțin clone de hibridom B, care sunt utilizate pe scară largă ca producători de anticorpi care vizează același antigen ca și anticorpii sintetizați de limfocitul B care a generat clona, ​​adică anticorpi monoclonali. Anticorpii monoclonali sunt omogene în proprietățile lor, au aceeași afinitate pentru antigen și se leagă de. un singur determinant antigenic. Acesta este un avantaj important al anticorpilor monoclonali - produse ale hibridomului B, în comparație cu anticorpii obținuți fără utilizarea ingineriei celulare, prin imunizarea unui animal de laborator cu un antigen selectat, urmată de izolarea anticorpilor din serul său sanguin sau ca rezultat de interacțiune directă a antigenului cu o populație de limfocite din cultura de țesut. Astfel de metode tradiționale produc un amestec de anticorpi care diferă ca specificitate și afinitate pentru antigen, ceea ce se explică prin participarea la producerea de anticorpi a multor clone diferite de limfocite B și prezența mai multor determinanți în antigen, fiecare dintre ele. corespunde unui anumit tip de anticorp. Astfel, anticorpii monoclonali se leagă selectiv de un singur antigen, inactivându-l, ceea ce are o mare importanță practică pentru recunoașterea și tratarea bolilor cauzate de agenți străini - bacterii, ciuperci, viruși, toxine, alergeni și celule proprii transformate (tumori canceroase). Anticorpi monoclonali utilizați cu succes în scopuri analitice pentru a studia organitele celulare, structura lor sau biomoleculele individuale.

Până de curând, doar celulele de mielom și limfocitele B de șoareci și șobolani au fost folosite pentru hibridizare. Anticorpii monoclonali produși de aceștia au o utilizare terapeutică limitată, deoarece ei înșiși reprezintă o proteină străină pentru corpul uman. Stăpânirea tehnologiei de obținere a hibridoamelor pe bază de celule imune umane este asociată cu dificultăți semnificative: hibridoamele umane cresc lent și sunt relativ instabile. Cu toate acestea, s-au obținut deja hibridoame umane - producători de anticorpi monoclonali. S-a dovedit că anticorpii monoclonali umani provoacă în unele cazuri reacții imune, iar eficacitatea lor clinică depinde de selecția corectă a clasei de anticorpi, linii de hibridom, potrivite pentru un anumit pacient. Avantajele anticorpilor monoclonali umani includ capacitatea de a recunoaște diferențe subtile în structura antigenului care nu sunt recunoscute de anticorpii monoclonali de șoarece sau șobolan. S-au făcut încercări de a obţine hibridoame himerice care combină celule de mielom de şoarece şi limfocite B umane; astfel de hibridoame au găsit până acum doar o aplicare limitată (tK-Haron, 1984).

Alături de avantajele neîndoielnice, anticorpii monoclonali au și dezavantaje care provoacă probleme în utilizarea lor practică. Nu sunt stabili atunci când sunt depozitați în stare uscată; în același timp, un amestec de anticorpi convenționali (policlonali) conține întotdeauna un grup de anticorpi care sunt stabili în condiții de depozitare selectate. Astfel, eterogenitatea anticorpilor convenționali le oferă o rezervă suplimentară de stabilitate în condiții externe în schimbare, ceea ce corespunde unuia dintre principiile principale pentru îmbunătățirea fiabilității sistemelor. Anticorpii monoclonali au adesea o afinitate prea scăzută pentru un antigen și o specificitate excesiv de îngustă, ceea ce împiedică utilizarea lor împotriva antigenelor variabile caracteristice agenților infecțioși și celulelor tumorale. De remarcat și costul foarte ridicat al anticorpilor monoclonali pe piața internațională.

Schema generală de obținere a hibridoamelor pe bază de celule de mielom și limfocite imune include următoarele etape.

1. Obținerea celulelor tumorale mutante care mor în timpul selecției ulterioare a celulelor hibridom. Abordarea standard este de a reproduce linii celulare de mielom care nu sunt capabile să sintetizeze enzime ale căilor de biosinteză ale purinei și pirimidinelor din hipoxantina și, respectiv, timidină (Fig. 6). Selecția unor astfel de mutanți ai celulelor tumorale se realizează folosind analogi toxici ai hipoxantinei și timidinei. Într-un mediu care conține acești analogi, supraviețuiesc doar celulele mutante, cărora le lipsesc enzimele hipoxantin-guanin fosforiboziltransferaza și timidin kinaza, care sunt necesare pentru căile de rezervă pentru biosinteza nucleotidelor.

Obținerea limfocitelor – producători de anticorpi la antigenele date. Un animal (șoarece, rar un șobolan, un iepure) este imunizat prin introducerea unui antigen în cavitatea abdominală, intravenos sau subcutanat. Pentru a obține hibridoame umane se recurge la imunizarea limfocitelor umane în cultura de țesut, care este mai complexă și

Unul dintre termenii din biotehnologie este conceptul de „biosistem”. Caracteristicile generalizate ale unui sistem biologic (viu) pot fi reduse la trei caracteristici principale inerente acestora:

1. Sistemele vii sunt sisteme deschise eterogene care fac schimb de materie și energie cu mediul.

2. Aceste sisteme sunt autoguvernante, autoreglabile și active, de ex. capabil să facă schimb de informații cu mediul pentru a-și menține structura și a controla procesele metabolice.

3. Sistemele vii se auto-reproduc (celule, organisme).

După structură, biosistemele sunt împărțite în elemente (subsisteme), interconectate și se caracterizează printr-o organizare complexă (atomi, molecule, organite, celule, organisme, populații, comunități).

Controlul într-o celulă este o combinație a proceselor de sinteză a moleculelor de proteine ​​​​-enzime necesare pentru implementarea unei anumite funcții și procesele continue de schimbare a activității în timpul interacțiunii codurilor triplete ADN din nucleu și macromoleculele din ribozomi. Întărirea și inhibarea activității enzimatice are loc în funcție de cantitatea de produse inițiale și finale ale reacțiilor biochimice corespunzătoare. Datorită acestei organizări complexe, biosistemele diferă de toate obiectele nevii.

Comportamentul unui biosistem este un set de reacții ale acestuia ca răspuns la influențe externe, adică sarcina cea mai comună a sistemelor de control ale organismelor vii este de a-și păstra baza energetică în condiții de mediu în schimbare.

N.M. Amosov împarte toate biosistemele în cinci niveluri ierarhice de complexitate: organisme unicelulare, organisme multicelulare, populații, biogeocenoză și biosferă.

organisme unicelulare sunt viruși, bacterii și protozoare. Funcțiile organismelor unicelulare sunt schimbul de materie și energie cu mediul, creșterea și diviziunea, reacțiile la stimuli externi sub formă de modificări ale metabolismului și forma de mișcare. Toate funcțiile organismelor unicelulare sunt susținute de procese biochimice de natură enzimatică și prin metabolismul energetic - de la metoda de obținere a energiei până la sinteza de noi structuri sau scindarea celor existente. Singurul mecanism al organismelor unicelulare care asigură adaptarea lor la mediu este mecanismul modificărilor genelor ADN individuale și, ca urmare, modificări ale proteinelor enzimatice și modificări ale reacțiilor biochimice.

Baza unei abordări sistematice a analizei structurilor biosistemelor este reprezentarea acesteia sub forma a două componente - energie și control.

Elementul principal este componenta energetică, notată cu MS (sistemul metabolic), și componenta de control, notată cu P (control genetic și fiziologic) și care transmite semnale de control către efectori (E). Una dintre funcțiile principale ale sistemului metabolic este de a furniza energie biosistemelor.

Structura biosistemelor este menținută prin mecanismele de control genetic. Primind energie și informații de la alte sisteme sub formă de produse metabolice (metaboliți), iar în timpul perioadei de formare - sub formă de hormoni, sistemul genetic controlează procesul de sinteză a substanțelor necesare și susține activitatea vitală a altui corp. sisteme, iar procesele din acest sistem decurg destul de lent.

În ciuda diversității biosistemelor, relația dintre proprietățile lor biologice rămâne invariabilă pentru toate organismele. Într-un sistem complex, posibilitățile de adaptare sunt mult mai mari decât într-unul simplu. Într-un sistem simplu, aceste funcții sunt asigurate de un număr mic de mecanisme, în timp ce sunt mai sensibile la schimbările din mediul extern.

Biosistemele se caracterizează prin eterogenitate calitativă, care se manifestă prin faptul că în cadrul aceluiași biosistem funcțional, subsisteme cu semnale de control adecvate calitativ diferite (chimice, fizice, informaționale) lucrează împreună și armonios.

Ierarhia biosistemelor se manifestă prin complicarea treptată a unei funcții la un nivel al ierarhiei și o tranziție bruscă la o funcție diferită calitativ la nivelul următor al ierarhiei, precum și în construcția specifică a diverselor biosisteme, analiza și analiza acestora. controlul într-o astfel de secvență încât funcția finală de ieșire a nivelului inferior al ierarhiei este inclusă ca element la nivelul superior.

Adaptarea constantă la mediu și evoluția sunt imposibile fără unitatea a două proprietăți opuse: organizarea structural-funcțională și probabilitatea structural-funcțională, stocasticitatea și variabilitatea.

Organizarea structurală și funcțională se manifestă la toate nivelurile biosistemelor și se caracterizează printr-o stabilitate ridicată a speciei biologice și a formei acesteia. La nivelul macromoleculelor, această proprietate este asigurată de replicarea macromoleculelor, la nivelul celulei - prin diviziune, la nivelul unui individ și populație - prin reproducerea indivizilor prin reproducere.

Ca obiecte sau sisteme biologice pe care le folosește biotehnologia, în primul rând, este necesară denumirea microorganismelor unicelulare, precum și a celulelor animale și vegetale. Alegerea acestor obiecte se datorează următoarelor puncte:

1. Celulele sunt un fel de „biofabrici” care produc pe parcursul vieții o varietate de produse valoroase: proteine, grăsimi, carbohidrați, vitamine, acizi nucleici, aminoacizi, antibiotice, hormoni, anticorpi, antigeni, enzime, alcooli etc. Multe dintre aceste produse, extrem de necesare vieții umane, nu sunt încă disponibile pentru obținerea prin metode „non-biotehnologice” din cauza deficitului sau a costului ridicat al materiilor prime.
sau complexitatea proceselor tehnologice;

2. Celulele se reproduc extrem de rapid. Astfel, o celulă bacteriană se divide la fiecare 20–60 de minute, o celulă de drojdie se divide la fiecare 1,5–2 ore, o celulă animală se divide la fiecare 24 de ore, ceea ce face posibilă creșterea artificială pe medii nutritive relativ ieftine și nedeficiente la scară industrială. într-un timp relativ scurt. cantități uriașe biomasă de celule microbiene, animale sau vegetale. De exemplu, într-un bioreactor cu o capacitate de 100 m3, 10-6-1018 celule microbiene pot fi crescute în 2-3 zile.În timpul vieții celulelor, atunci când sunt crescute, o cantitate mare de produse valoroase intră în mediu, iar celulele în sine sunt cămarele acestor produse;

3. Biosinteza substanțe complexe, precum proteinele, antibioticele, antigenele, anticorpii etc. sunt mult mai economice și mai accesibile din punct de vedere tehnologic decât sinteza chimică. În același timp, materia primă inițială pentru biosinteză, de regulă, este mai simplă și mai accesibilă decât materiile prime pentru alte
tipuri de sinteză. Pentru biosinteză, deșeuri din agricultură, produse piscicole, Industria alimentară, materii prime vegetale (zer, drojdie, lemn, melasa etc.)

4. Posibilitatea efectuării unui proces biotehnologic la scară industrială, i.e. disponibilitatea echipamentelor tehnologice adecvate, disponibilitatea materiilor prime, tehnologii de prelucrare etc.

Astfel, natura a oferit cercetătorilor un sistem viu care conține și sintetiza componente unice și, în primul rând, acizi nucleici, odată cu descoperirea cărora biotehnologia și știința mondială în general au început să se dezvolte rapid.

Obiectele biotehnologiei sunt virusurile, bacteriile, ciupercile, organismele protozoare, celulele (țesuturile) plantelor, animalelor și oamenilor, substanțe de origine biologică (de exemplu, enzime, prostaglandine, lectine, acizi nucleici), molecule.

În acest sens, se poate spune că obiectele biotehnologiei se referă fie la microorganisme, fie la celule vegetale și animale. La rândul său, organismul poate fi caracterizat ca un sistem de sinteză economică, complexă, compactă, intenționată, care se desfășoară în mod constant și activ cu menținerea optimă a tuturor parametrilor necesari.

Metodele utilizate în biotehnologie sunt determinate de două niveluri: celular și molecular. Ambele sunt determinate de obiecte biologice.

În primul caz, se ocupă cu celule bacteriene (pentru producerea de vaccinuri), actinomicete (pentru producerea de antibiotice), micromicete (pentru producerea de acid citric), celule animale (pentru fabricarea vaccinurilor antivirale), celule umane (pentru fabricarea interferonului), etc.

În al doilea caz, se ocupă cu molecule, de exemplu, cu acizi nucleici. Cu toate acestea, în etapa finală, nivelul molecular este transformat în cel celular. Celulele animalelor și plantelor, celulele microbiene aflate în procesul vieții (asimilare și disimilare) formează noi produse și eliberează metaboliți cu diverse compoziții fizico-chimice și acțiuni biologice.

Când o celulă crește, în ea au loc un număr mare de reacții catalizate de enzime, în urma cărora se formează compuși intermediari, care la rândul lor se transformă în structuri celulare. Compușii intermediari, blocurile de construcție includ 20 de aminoacizi, 4 ribonucleotide, 4 dezoxiribonucleotide, 10 vitamine, monozaharide, acizi grași, hexozamine. Din aceste „blocuri” se construiesc „blocuri”: aproximativ 2000 de proteine, ADN, trei tipuri de ARN, polizaharide, lipide, enzime. „Blocuri” rezultate sunt folosite pentru a construi structuri celulare: nucleul, ribozomii, membrana, peretele celular, mitocondriile, flagelii etc., care alcătuiesc celula.

La fiecare etapă a „sintezei biologice” a celulei, este posibil să se determine acele produse care pot fi utilizate în biotehnologie.

De obicei, produsele unicelulare sunt împărțite în 4 categorii:

a) celulele în sine ca sursă a produsului țintă. De exemplu, bacteriile sau virusurile cultivate sunt utilizate pentru a produce un vaccin cu particule vii sau ucise; drojdie ca proteină furajeră sau bază pentru obținerea de hidrolizate de medii nutritive etc.;

b) molecule mari care sunt sintetizate de celule în procesul de creștere: enzime, toxine, antigeni, anticorpi, peptidoglicani etc.;

c) metaboliți primari - substanțe cu greutate moleculară mică (mai puțin de 1500 daltoni) necesare creșterii celulare, precum aminoacizi, vitamine, nucleotide, acizi organici;

d) metaboliți secundari (idioliți) - compuși cu greutate moleculară mică care nu sunt necesari creșterii celulare: antibiotice, alcaloizi, toxine, hormoni.

Biotehnologia folosește această producție de celule ca materie primă, care, ca urmare a prelucrării tehnologice, se transformă într-un produs final, utilizabil.

Toate micro-obiectele utilizate în biotehnologie sunt denumite acariot, pro- sau eucariote. Din grupul eucariotelor, de exemplu, funcționează ca obiecte biologice cu celule de protozoare, alge și ciuperci, din grupul de procariote - cu celule de alge și bacterii albastru-verzi, acariote - cu viruși.

Bioobiectele din microlume variază în mărime de la nanometri (viruși, bacteriofagi) la milimetri și centimetri (alge gigantice) și se caracterizează printr-o rată relativ rapidă de reproducere. Industria farmaceutică modernă utilizează o gamă gigantică de obiecte biologice, a căror grupare este foarte complexă și poate fi realizată cel mai bine pe baza principiului proporționalității lor.

Un set imens de obiecte biologice nu epuizează întreaga bază elementară cu care operează biotehnologia. Progresele recente în biologie și inginerie genetică au dus la apariția unor obiecte biologice complet noi - bacterii transgenice (modificate genetic), viruși, ciuperci, celule vegetale, animale, umane și himere.

În ciuda faptului că reprezentanții tuturor superregurilor conțin material genetic, diferitelor acariote le lipsește orice tip de acid nucleic (ARN sau ADN). Ele nu sunt capabile să funcționeze (inclusiv să se reproducă) în afara unei celule vii și, prin urmare, este legitim să le numim fără nucleu. Parazitismul virusurilor se dezvoltă la nivel genetic.

Examinarea țintită a diferitelor nișe ecologice relevă grupuri tot mai noi de microorganisme care produc substanțe utile care pot fi utilizate în biotehnologie. Numărul de tipuri de microorganisme utilizate în biotehnologie este în continuă creștere.

Atunci când alegeți un obiect biologic, în toate cazurile este necesar să respectați principiul fabricabilității. Deci, dacă în timpul numeroaselor cicluri de cultivare proprietățile unui obiect biologic nu sunt conservate sau suferite schimbări semnificative, atunci acest obiect biologic ar trebui recunoscut ca netehnologic, i.e. inacceptabil pentru evoluţiile tehnologice care urmează stadiului cercetării de laborator.

Odată cu dezvoltarea biotehnologiei, băncile specializate de obiecte biologice, în special, colecțiile de microorganisme cu proprietăți studiate, precum și criobancile de celule animale și vegetale, sunt de mare importanță, care pot fi deja utilizate cu succes folosind metode speciale pentru a construi noi organisme utile pentru biotehnologie. De fapt, aceste bănci de culturi specializate sunt responsabile pentru menținerea unui pool genetic extrem de valoros.

Colecțiile de cultură joacă un rol important în protecția legală a noilor culturi și în standardizarea proceselor biotehnologice. În colecții, conservarea, întreținerea și asigurarea microorganismelor cu tulpini, plasmide, fagi, linii celulare se realizează atât pentru cercetare științifică și aplicată, cât și pentru industriile relevante. Colecțiile de culturi, pe lângă sarcina principală - asigurarea viabilității și păstrării proprietăților genetice ale tulpinilor - contribuie la dezvoltarea cercetării științifice (în domeniul taxonomiei, citologiei, fiziologiei) și servesc și ca scopuri educaționale. Ele îndeplinesc o funcție indispensabilă de depozitare a tulpinilor brevetabile. Conform regulilor internaționale, nu numai producătorii eficienți, ci și culturile utilizate în inginerie genetică pot fi brevetate și depozitate.

Oamenii de știință acordă multă atenție creării intenționate de noi obiecte biologice care nu există în natură. În primul rând, trebuie remarcată crearea de noi celule de microorganisme, plante, animale prin inginerie genetică. Crearea de noi obiecte biologice, desigur, contribuie la îmbunătățirea protecției juridice a invențiilor din domeniul ingineriei genetice și al biotehnologiei în general. S-a format o direcție care se ocupă de proiectarea celulelor artificiale. În prezent, există metode care fac posibilă obținerea de celule artificiale folosind diverse materiale sintetice și biologice, de exemplu, o membrană celulară artificială cu o anumită permeabilitate și proprietăți de suprafață. Unele materiale pot fi închise în interiorul unor astfel de celule: sisteme enzimatice, extracte celulare, celule biologice, materiale magnetice, izotopi, anticorpi, antigeni, hormoni etc. Utilizarea celulelor artificiale a dat rezultate pozitive în producerea de interferoni și anticorpi monoclonali, în crearea de imunosorbenti etc.

Sunt dezvoltate abordări pentru a crea enzime artificiale și analogi de enzime cu stabilitate și activitate crescute. De exemplu, se realizează sinteza polipeptidelor cu stereoconfigurarea dorită, se caută metode de mutageneză dirijată pentru a înlocui un aminoacid cu altul în molecula de enzimă. Se încearcă construirea unor modele catalitice non-enzimatice.

Următoarele grupuri de obiecte biologice ar trebui evidențiate ca fiind cele mai promițătoare:

Recombinanți, adică organisme obținute prin inginerie genetică;

Celule de țesut vegetal și animal;

Microorganisme și enzime termofile;

organisme anaerobe;

Asociații pentru transformarea substraturilor complexe;

Obiecte biologice imobilizate.

Procesul de creare artificială a unui obiect biologic (microorganism, sau celulă tisulară) constă în modificarea informațiilor genetice ale acestuia pentru a exclude nedorite și a spori proprietățile dorite sau a-i conferi calități complet noi. Cele mai țintite schimbări pot fi făcute prin recombinare - redistribuirea genelor sau a părților de gene și combinarea informațiilor genetice de la două sau mai multe organisme într-un singur organism. Obținerea organismelor recombinate, în special, poate fi realizată prin fuziunea protoplastelor, prin transfer de plasmide naturale și prin metode de inginerie genetică.

Agenții biologici netradiționali în acest stadiu al dezvoltării biotehnologiei includ celule de țesut vegetal și animal, inclusiv hibridoame, transplanturi. Culturile de celule de mamifere produc deja interferon și vaccinuri virale; în viitorul apropiat, se va realiza producția pe scară largă de anticorpi monoclonali, antigeni de suprafață ai celulelor umane și factori angiogeni.

Odată cu dezvoltarea metodelor biotehnologice, se va acorda din ce în ce mai multă atenție utilizării microorganismelor termofile și a enzimelor acestora.

Enzimele produse de microorganismele termofile se caracterizează prin stabilitate termică și rezistență mai mare la denaturare în comparație cu enzimele de la mezofile. Efectuarea proceselor biotehnologice la temperaturi ridicate folosind enzime ale microorganismelor termofile are o serie de avantaje:

1) viteza de reacție crește;

2) crește solubilitatea reactivilor și din acest motiv - productivitatea procesului;

3) se reduce posibilitatea contaminării microbiene a mediului de reacţie.

Există o revigorare a proceselor biotehnologice folosind microorganisme anaerobe, care sunt adesea și termofile. Procesele anaerobe atrag atenția cercetătorilor din cauza lipsei de energie și a posibilității de a obține biogaz. Deoarece cultivarea anaerobă nu necesită aerarea mediului şi procese biochimice mai puțin intens, sistemul de îndepărtare a căldurii este simplificat, procesele anaerobe pot fi considerate economisitoare de energie.

Microorganismele anaerobe sunt utilizate cu succes pentru a procesa deșeurile (biomasă vegetală, deșeuri din industria alimentară, deșeuri menajere etc.) și efluenți (efluenți domestici și industriali, gunoi de grajd) în biogaz.

În ultimii ani, utilizarea culturilor mixte de microorganisme și a asociațiilor lor naturale s-a extins. Într-o situație biologică reală în natură, microorganismele există sub formă de comunități de diferite populații care sunt strâns legate între ele și realizează circulația substanțelor în natură.

Principalele avantaje ale culturilor mixte în comparație cu monoculturile sunt următoarele:

Capacitatea de a utiliza substraturi complexe, eterogene, adesea nepotrivite pentru monoculturi;

Capacitatea de a mineraliza compuși organici complecși;

Capacitate de biotransformare crescută materie organică;

Rezistență crescută la substanțe toxice, inclusiv metale grele;

Rezistență crescută la influențele mediului;

Productivitate crescuta;

Posibil schimb informația geneticăîntre diferite tipuri de comunitate.

Este necesar să se evidențieze un astfel de grup de obiecte biologice precum enzimele-catalizatori de origine biologică, care sunt studiate sub aspect aplicativ prin enzimologia inginerească. Sarcina sa principală este dezvoltarea proceselor biotehnologice care utilizează acțiunea catalitică a enzimelor, de obicei izolate din sistemele biologice sau situate în interiorul celulelor lipsite artificial de capacitatea de a crește. Datorită enzimelor, viteza reacțiilor crește cu un factor de 106-1012 în comparație cu reacțiile care apar în absența acestor catalizatori.

Obiectele biologice imobilizate ar trebui evidențiate ca o ramură separată a creării și utilizării obiectelor biologice. Obiectul imobilizat este un sistem armonios, a cărui acțiune este în general determinată de selectarea corectă a trei componente principale: obiectul biologic, purtătorul și metoda de legare a obiectului de purtător.

Următoarele grupuri de metode de mobilizare a obiectelor biologice sunt utilizate în principal:

Includerea în geluri, microcapsule;

Adsorbție pe purtători insolubili;

Legare covalentă la un purtător;

Reticulare cu reactivi bifuncționali fără utilizarea unui purtător;

- „autoagregare” în cazul celulelor intacte.

Principalele avantaje ale utilizării obiectelor biologice imobilizate sunt:

activitate ridicată;

Abilitatea de a controla micromediul agentului;

posibilitatea de separare completă și rapidă a produselor țintă;

Posibilitatea de a organiza procese continue cu utilizare multiplă a obiectului.

După cum rezultă din cele de mai sus, în procesele biotehnologice este posibil să se utilizeze o serie de obiecte biologice caracterizate prin diferite niveluri de complexitate ale reglării biologice, de exemplu, celulare, subcelulare, moleculare. Abordarea creării întregului sistem biotehnologic în ansamblu depinde direct de caracteristicile unui anumit obiect biologic.

Drept administrativ și metode de administrație publică

Metode active, interactive și alte metode inovatoare (tehnologii) folosite pentru a forma

Analiza teoriilor de motivare a activității de muncă a personalului și a metodelor de creștere a acesteia

Ticket5Metode pentru studiul geneticii umane. Metode biochimice și gemene, sarcinile lor.2. Anchilostoma și necator. Ciclul de viață și semnificația medicală

B. Principalele metode de selecție utilizate în recrutarea personalului în organizație

1. Ce este biotehnologia? În ce domenii ale activității umane sunt utilizate procesele biotehnologice?

Biotehnologia este un domeniu al științei și activitati practice asociat cu producerea de diverse produse folosind organisme vii, celule de cultură și procese biologice. Procesele biotehnologice sunt utilizate în panificația, vinificația, obținerea produselor lactate fermentate, prelucrarea pieilor etc.

2. Care sunt principalele direcții ale biotehnologiei?

Principalele direcții ale biotehnologiei: producerea de compuși biologic activi și medicamente (enzime, vitamine, hormoni, antibiotice, imunoglobuline etc.) folosind microorganisme și celule eucariote cultivate; producția de produse alimentare și hrană pentru animale; crearea de noi tulpini utile de microorganisme, soiuri de plante și rase de animale; dezvoltarea și utilizarea metodelor biologice de protecție a plantelor împotriva dăunătorilor și bolilor; crearea și utilizarea metodelor biotehnologice de protecție a mediului etc.

3. Ce este ingineria celulară? Ce metode de inginerie celulară cunoașteți? Care sunt rezultatele aplicării lor?

Ingineria celulară este cultivarea celulelor de plante, animale și microorganisme în condiții speciale, inclusiv diverse manipulări cu acestea (fuziune celulară, îndepărtarea sau transplantul de organite etc.). Metodele de inginerie celulară includ: înmulțirea plantelor pe baza culturii de țesuturi, hibridizarea somatică. Hibridizarea somatică este fuziunea diferitelor tipuri de celule somatice ale unui organism sau a celulelor organismelor aparținând tipuri diferite. Folosind această metodă, de exemplu, s-au creat hibrizi care nu pot fi obținuți prin încrucișarea indivizilor - hibrizi de tutun și cartofi, morcovi și pătrunjel, roșii și cartofi etc.

4. Ce este ingineria genetică? Numiți principalele instrumente ale ingineriei genetice.

Ingineria genetică (genică) este o secțiune a biologiei moleculare asociată cu izolarea genelor din celulele organismelor vii, implementarea diferitelor manipulări cu acestea (inclusiv crearea de molecule hibride de ADN) și introducerea lor în alte organisme. Principalele instrumente ale ingineriei genetice sunt enzimele și vectorii. Folosind un set de enzime speciale, este posibil să tăiați molecule de ADN și ARN în anumite zone, să extrageți fragmentele necesare din ele, să copiați și să cusați aceste fragmente între ele.

5. Ce organisme se numesc transgenice? Ce metode de obținere a animalelor transgenice puteți numi?

Organismele vii al căror genom a fost modificat prin operațiuni de inginerie genetică și conține cel puțin o genă funcțională activă a altui organism sunt numite transgenice (modificate genetic). Una dintre principalele metode de obținere a animalelor transgenice este microinjecția de ADN în ouă fecundate. Totul începe cu introducerea unui fragment de ADN care conține mai multe copii ale genei dorite în nucleul spermei care a fertilizat ovulul. După ce are loc fuziunea nucleară, zigoții modificați sunt transferați în uterul femelei primitoare. După un timp, ea dă naștere unor copii transgenici. În ultimii ani, celulele stem embrionare obținute din embrioni în stadiile incipiente de dezvoltare au fost, de asemenea, folosite pentru a crea animale transgenice. Aceste celule se pot diferenția în orice alte tipuri de celule ale unui organism multicelular.

6. În 1962, savantul britanic J. Gurdon a efectuat următorul experiment. Cu ajutorul radiațiilor ultraviolete într-un ou de broască fecundat, nucleul a fost distrus. Apoi, un nucleu prelevat dintr-o celulă intestinală a unei broaște adulte a fost transplantat într-un zigot fără nucleu. Un astfel de zigot neobișnuit a început să se despartă și în cele din urmă sa dezvoltat într-o broască normală. J. Gurdon și adepții săi au continuat cercetările în acest domeniu. În 2012, J. Gurdon a devenit laureat Premiul Nobel. Ce concluzii se pot trage din experimentul descris? Ce credeți, care a fost semnificația și continuarea experimentelor lui J. Gurdon?

Din descrierea de mai sus rezultă clar că J. Gurdon, ca rezultat al experimentului său, a fost primul care a obținut o clonă de animal (broască) crescută din celule diferențiate ale unui animal adult.

1. Informatii generale despre obiectele biologice

Obiectele biotehnologiei sunt viruși, bacterii, ciuperci - micromicete și macromicete, organisme protozoare, celule (țesuturi) plante, animale și oameni, unele substanțe biogene și similare funcțional (de exemplu, enzime, prostaglandine, lectine, acizi nucleici etc. ). În consecință, obiectele biotehnologiei pot fi reprezentate de particule organizate (virusuri), celule (țesuturi) sau metaboliții acestora (primari, secundari). Chiar și atunci când o biomoleculă este utilizată ca obiect al biotehnologiei, biosinteza sa inițială este efectuată în majoritatea cazurilor de celulele corespunzătoare. În acest sens, se poate spune că obiectele biotehnologiei se referă fie la microbi, fie la organisme vegetale și animale. La rândul său, organismul poate fi caracterizat figurativ ca un sistem de producție biochimică economică, complexă, compactă, autoreglabilă și, prin urmare, intenționată, care se desfășoară în mod constant și activ, menținând în același timp toți parametrii necesari. Din această definiție rezultă că virușii nu sunt organisme, dar în funcție de conținutul moleculelor de ereditate, adaptabilitate, variabilitate și alte proprietăți, ei aparțin reprezentanților vieții sălbatice.

După cum se poate observa din diagrama de mai sus, obiectele biotehnologiei sunt extrem de diverse, gama lor se extinde de la particule organizate (viruși) până la oameni.

Virușii ocupă o poziție între natura animată și cea neînsuflețită, nu au nucleu, deși există un material nuclear ereditar - acidul ribonucleic (ARN) sau acidul dezoxiribonucleic (ADN).

Spre deosebire de microbii de organizare celulară, ARN-ul și ADN-ul nu se găsesc niciodată împreună în particulele virale.

În prezent, majoritatea obiectelor din biotehnologie sunt microbi aparținând celor trei regate (non-nuclear, pre-nuclear, nuclear) și cinci regate (virusuri, bacterii, ciuperci, plante și animale). Mai mult, primele două regate constau exclusiv din microbi, în timp ce al treilea este predominant din plante și animale.

În prima jumătate a secolului al XIX-lea. s-a făcut una dintre cele mai elementare generalizări ale biologiei - teoria celulară (M. Schleiden, T. Schwann, R. Virchow), care a devenit general recunoscută. De asemenea, s-a dovedit a fi fundamentul științei - citologie (din grecescul kitos - cavitate). Dintre toate obiectele biotehnologiei, doar virușii, viroizii și biomoleculele nu au o organizare celulară. Cu toate acestea, virușii, în timp ce se află în celule, se comportă ca niște ființe vii - se replic ("se multiplică") și materialul lor genetic funcționează în principal conform legilor generale inerente celulelor de orice origine. Pe măsură ce metodele și tehnicile de cercetare citologică se îmbunătățesc, oamenii de știință pătrund mai adânc în esența particulelor și celulelor organizate și, ca urmare a unei astfel de pătrunderi, este posibil să se fundamenteze apartenența tuturor ființelor vii la trei regate: Acaryotae - nenuclear , Procaryotae - pre-nuclear și Eucaryotae - nuclear (din greacă a - nu, pro - înainte, ea - bună, complet, karyon - miez). Prima include particule organizate - viruși și viroizi, a doua - bacterii, a treia - toate celelalte organisme (ciuperci, alge, plante, animale).

În ciuda faptului că reprezentanții tuturor superregurilor conțin material genetic, diferitelor acariote le lipsește orice tip de ARN sau ADN de acid nucleic. Ele nu sunt capabile să funcționeze (inclusiv să se reproducă) în afara unei celule vii și, prin urmare, este legitim să le numim fără nucleu.

Celulele ciupercilor, algelor, plantelor și animalelor au un nucleu real separat de citoplasmă și, prin urmare, sunt denumite eucariote.

Clasificarea procariotelor și eucariotelor se bazează pe numeroase diferențe structurale, dintre care principalele sunt următoarele: 1) prezența sau absența unui nucleu care conține ADN cromozomial; 2) structura și compoziția chimică a peretelui celular și 3) prezența sau absența organitelor citoplasmatice subcelulare. Într-o celulă procariotă, cum ar fi una bacteriană, ADN-ul cromozomial este localizat direct în citoplasmă, celula este înconjurată de un perete celular rigid, care conține adesea peptidoglican, dar nu chitină sau celuloză; nu există organele citoplasmatice subcelulare în celulă. Într-o celulă eucariotă există un nucleu separat de citoplasmă printr-o membrană nucleară, ADN-ul cromozomial este localizat în nucleu; peretele celular, dacă este prezent, poate conţine chitină sau celuloză, dar nu peptidoglican; citoplasma contine diverse organite subcelulare (mitocondrii, aparat Golgi, cloroplast in celulele vegetale) (Fig. 1).

Orez. 1. Schema unei celule bacteriene procariote (A) și a unei celule animale eucariote (B)

2. Viruși și viroizi

Acizii nucleici sunt substanțele ereditare ale virusurilor. În funcție de tipul de acid nucleic, aceștia sunt împărțiți în viruși care conțin ARN și viruși care conțin ADN. Primii includ toți virusurile plantelor, cei din urmă includ majoritatea bacteriofagelor, o serie de viruși umani și animale (adenovirusuri, virusuri herpetice, vaccinia etc.).

Proteina este structurată în jurul acidului nucleic viral (genom) sub formă de înveliș și se numește capsidă. Forma unui virion este determinată de capside. Impreuna cu acid nucleic capsida formează nucleocapsidul.

O listă aproximativă de viruși include 17 familii de virusuri vertebrate și 7 familii de virusuri nevertebrate, 10 familii de virusuri bacteriene. Au fost descrise 20 de genuri de virusuri ale plantelor și 5 genuri de viruși fungici. Schemele de clasificare a virusurilor nu sunt încă pe deplin stabilite și, în plus, deschid noi viruși pentru știință (de exemplu, cu virusuri Ebola, imunodeficiență umană). Reprezentanții virusurilor care conțin ADN sunt virușii molluscum contagiosum, variola, herpesul, majoritatea fagilor bacterieni; Virușii care conțin ARN sunt virușii plantelor, gripa umană, rabia, poliomielita etc.

Viroidii. Conform structurii moleculare, viroizii sunt molecule de ARN circulare, monocatenar închise covalent, lipsite de capside. Numărul de nucleotide dintr-un astfel de ARN este în intervalul 240-400. Ca formă, viroizii pot fi liniari și în formă de inel, sunt capabili să adopte un ac de păr, conformație cvasi-dublu catenară (din latină quasi - presupus, ca și cum, aproape, aproape; conformatio - formă, aranjament). Fiecare tip de viroid conține un tip unic, unic, special de ARN cu greutate moleculară mică. Dimensiunile viroizilor sunt de 15 nm. În celulele sensibile ale plantelor gazdă, acestea sunt concentrate în nucleu, asociate cu nucleolul sub formă de complex proteină-acid nucleic, și se reproduc autonom în întregime cu ajutorul enzimelor gazdă anterioare sau activate. Viroidii nu sunt traduși. Acest lucru este confirmat de similitudinea lor structurală între ele și de absența codonilor inițiatori într-un număr de viroizi. În același timp, replicarea are loc datorită transcripției secvențelor de ARN viroid din șablonele de ARN cu participarea ARN polimerazelor.

3. Bacterii

Bacteriile sunt creaturi de organizare celulară în care materialul nuclear nu este separat de citoplasmă prin membrane elementare și nu este asociat cu nicio proteină de bază. Citoplasma din ele cu ribozomi împrăștiați neregulat este nemișcată, celulele nu au capacitatea de a endo- și exocitoză. Majoritatea bacteriilor sunt unicelulare, diametrul lor cel mai mic este de 0,2-10,0 microni.

Toate bacteriile alcătuiesc un singur regn Bacteriile, deși unele dintre ele - arheobacteria (Archaeobacteria) sunt semnificativ diferite de altele, numite eubacterii (Eubacteria). Evident, arheobacterii sunt reprezentanți mai vechi ai procariotelor decât eubacterii. Ei trăiesc în medii cu condiții extreme - concentrații mari de săruri anorganice, temperaturi ridicate, monoxid și dioxid de carbon - ca singure surse de carbon. Arheobacterii includ halobacteriile, bacteriile termoacidofile și bacteriile formatoare de metan sau metanogene.

Bacteriile fototrofe sunt cianobacteriile oxigenate, bacteriile anoxigenice violet și verzi; chimiotrofice - bacterii și bacili gram-pozitive și gram-negative, mixobacterii, bacterii cu tulpină și înmugurire, vibrio, spirilla, spirochete, actinomicete, corinebacterii, micobacterii, rickettsia, chlamydia, micoplasma și spiroplasma.

Bacterie Escherichia coli unul dintre cele mai bine studiate organisme. În ultimii ani, a fost posibil să se obțină informații cuprinzătoare despre genetica, biologia moleculară, biochimie, fiziologie și biologia generală. Este o tijă mobilă Gram-negativă, nepatogenă, cu lungimea mai mică de 1 µm. Habitatul său este intestinele umane, dar poate fi semănat și din sol și apă. Datorită capacității de a se înmulți prin simplă diviziune pe medii care conțin numai ioni Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+, NH 4 +, Cl ~, HP0 4 2 ~ și S0 4 2 ~, oligoelemente și un carbon sursă (de exemplu, glucoză), E. coli a devenit subiectul preferat al cercetării științifice. La cultivare E. coli pe medii nutritive lichide îmbogățite care conțin aminoacizi, vitamine, săruri, oligoelemente și o sursă de carbon, timpul de generare (adică timpul dintre formarea unei bacterii și divizarea acesteia) în faza de creștere logaritmică la o temperatură de 37 ° C este de aproximativ 22 de minute.

Pentru fiecare organism viu, există un anumit interval de temperatură care este optim pentru creșterea și reproducerea acestuia. Temperaturile prea ridicate determină denaturarea proteinelor și distrugerea altor componente celulare importante, ducând la moartea celulelor. La temperaturi scăzute, procesele biologice încetinesc semnificativ sau se opresc complet din cauza modificărilor structurale pe care le suferă moleculele de proteine. Bazat regim de temperatură care preferă anumite microorganisme, pot fi împărțite în termofile (de la 45 la 90 ° C și mai sus), mezofile (de la 10 la 47 ° C) și psicrofile, sau psicrotrofe (de la -5 la 35 ° C). Microorganismele care se reproduc activ doar într-un anumit interval de temperatură pot fi un instrument util pentru rezolvarea diferitelor probleme biotehnologice. De exemplu, termofilele furnizează adesea gene care codifică enzime termostabile care sunt utilizate în procesele industriale sau de laborator, în timp ce psicrotrofele modificate genetic sunt folosite pentru a biodegrada deșeurile toxice conținute în sol și apă la temperaturi scăzute.

E. coli poate fi cultivat atât în ​​condiții aerobe (în prezența oxigenului), cât și în condiții anaerobe (fără oxigen). Cu toate acestea, pentru producția optimă de proteine ​​recombinante E. coli iar alte microorganisme sunt de obicei crescute în condiții aerobe. Dacă scopul cultivării bacteriilor în laborator este sinteza și izolarea unei anumite proteine, atunci culturile sunt crescute pe medii nutritive lichide complexe în baloane. Pentru a menține temperatura dorită și a asigura o aerare suficientă a mediului de cultură, baloanele se pun într-o baie de apă sau într-o cameră termostatată și se agită continuu. O astfel de aerare este suficientă pentru reproducerea celulară, dar nu întotdeauna pentru sinteza proteinelor. Creșterea masei celulare și producția de proteine ​​nu sunt limitate de conținutul de surse de carbon sau de azot din mediul nutritiv, ci de conținutul de oxigen dizolvat: la 20 ° C, este de aproximativ nouă milionimi. Acest lucru devine deosebit de important în producția industrială de proteine ​​recombinate cu ajutorul microorganismelor. Pentru a asigura condiții optime pentru producția maximă de proteine, sunt proiectate fermentatoare speciale și sunt create sisteme de aerare.

Inafara de E. coli, multe alte microorganisme sunt folosite în biotehnologia moleculară. Ele pot fi împărțite în două grupe: microorganisme ca surse de gene specifice și microorganisme create prin metode de inginerie genetică pentru a rezolva anumite probleme. Genele specifice includ, de exemplu, o genă care codifică o ADN polimerază termostabilă, care este utilizată în reacția în lanț a polimerazei (PCR) utilizată pe scară largă. Această genă a fost izolată din bacterii termofile și donată în E. coli. Al doilea grup de microorganisme include, de exemplu, diverse tulpini Corynebacterium glutamicum, care au fost modificate genetic pentru a crește producția de aminoacizi importanți din punct de vedere industrial.

4. Ciuperci

Funcțiile biotehnologice ale ciupercilor sunt diverse. Acestea sunt folosite pentru a obține produse precum:

antibiotice (penicillium, streptomicete, cefalosporine);

gibereline și citokinine (physarium și botrytis);

carotenoizi (de exemplu, astaxantina, care conferă cărnii peștelui somon o nuanță roșu-portocalie, este produsă de Rhaffia rhodozima, care este adăugată pentru hrana la fabricile de pește);

proteine ​​(Candida, Saccharomyces lipolitica);

Brânzeturi precum Roquefort și Camembert (penicilla);

sos de soia (Aspergillus oryzae).

Ciupercile includ actinomicete, drojdii și mucegaiuri. Actinomicetele adevărate sunt aerobe stricte, sunt gram-pozitive și nu formează spori. Cel mai reprezentativ din acest grup este genul Streptomyces, dintre care unele specii produc antibiotice utilizate pe scară largă. Când cresc pe medii solide, actinomicetele formează un miceliu foarte subțire cu hife aeriene, care se diferențiază în lanțuri de conidiospori. Fiecare conidiospor este capabil să formeze o microcolonie.

Antibioticele sunt produse și de un alt tip de actinomicete, Micromonospora, ale căror colonii sunt lipsite de hife aeriene și formează conidiospori direct pe miceliu.

Dintre cele 500 de specii de drojdie cunoscute, Saccharomyces cerevisiae a fost prima folosită de oameni și este cea mai intens cultivată. Drojdie Saccharomyces cerevisiae sunt microorganisme unicelulare nepatogene cu un diametru celular de aproximativ 5 µm, care în multe privințe reprezintă analogul eucariot E. coli. Genetica, biologia moleculară și metabolismul lor au fost studiate în detaliu. S. cere visiae se reproduc prin înmugurire și se dezvoltă bine în același mediu simplu ca E. coli. Capacitatea lor de a transforma zahărul în etanol și dioxid de carbon a fost folosit de multă vreme pentru fabricarea băuturilor alcoolice și a pâinii. Drojdie S. cerevisiae prezintă şi un mare interes ştiinţific. În special, ele sunt modelul cel mai convenabil pentru studiul altor eucariote, inclusiv al oamenilor, deoarece multe dintre genele responsabile de reglarea diviziunii celulare S. cerevisiae sunt asemănătoare cu cele de la om. Această descoperire a contribuit la identificarea și caracterizarea genelor umane responsabile de dezvoltarea neoplasmelor. Sistemul genetic de drojdie utilizat pe scară largă (cromozom artificial) este un participant indispensabil în toate studiile ADN-ului uman. În 1996, a fost determinată secvența completă de nucleotide a întregului set de cromozomi. S. cerevisiae, ceea ce a crescut și mai mult valoarea acestui microorganism pentru cercetarea științifică.

O proteină eucariotă sintetizată de o celulă bacteriană trebuie adesea supusă unei modificări enzimatice prin atașarea compușilor cu greutate moleculară mică la molecula de proteină - în multe cazuri acest lucru este necesar pentru buna funcționare a proteinei. Din pacate, E. coliși alte procariote nu sunt capabile să efectueze aceste modificări, prin urmare, pentru a obține proteine ​​eucariote cu drepturi depline, S. cerevisiae, precum și alte tipuri de drojdie: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces diastatic, Schizisaccharomyces pombe, Yarrowia lipolitica, Pichia pastoris, Hansenula polymogra. Cei mai eficienți producători de proteine ​​recombinante complete sunt P. pastoris si n. polymogra.

Drojdiile de fermentare a lactozei includ Kluyveromyces fragilis, care este folosit pentru a obține alcool din zer. Saccharomycopsis lipolitica degradează hidrocarburile și se folosește la obținerea masei proteice. Toate cele trei specii aparțin clasei Ascomycetes. Alte specii utile aparțin clasei deuteromicetelor (ciuperci imperfecte), deoarece nu se reproduc sexual, ci prin înmugurire. candida utilis crește în apele uzate sulfite (deșeuri din industria hârtiei). Trichosporon cutanat, oxidarea a numeroși compuși organici, inclusiv a unora toxici (ex. fenol), joacă un rol important în sistemele aerobe de tratare a apelor uzate. Phaffia rhodozyma sintetizează astaxantina, un carotenoid care conferă cărnii păstrăvului și somonului de crescătorie culoarea caracteristică portocalie sau roz. Drojdiile industriale nu se reproduc de obicei sexual, nu formează spori și sunt poliploide. Acesta din urmă explică puterea și capacitatea lor de a se adapta la schimbările din mediul de cultivare (în mod normal, nucleul celular S.cerevisiae conţine 17 sau 34 de cromozomi, adică celulele sunt fie haploide, fie diploide).

Mucegaiurile provoacă numeroase transformări în mediile solide care apar înainte de fermentare. Prezența lor explică hidroliza amidonului de orez în producția de sake și hidroliza boabelor de soia, orezului și malțului în producția de alimente consumate în țările asiatice. Produse alimentare pe bază de mucegaiuri fermentate Rhizopus oligosporus soia sau grâul conțin de 5-7 ori mai multe vitamine precum riboflavina, acidul nicotinic) și au un conținut de proteine ​​de câteva ori mai mare. Mucegaiurile produc și enzime industriale (amilaze, pectinaze etc.), acizi organici și antibiotice. Ele sunt, de asemenea, utilizate în producția de brânzeturi, cum ar fi Camembert și Roquefort.

Cultura artificială a ciupercilor poate aduce și o altă contribuție, nu mai puțin importantă, la furnizarea de hrană pentru populația în creștere a globului. Oamenii mănâncă ciuperci din cele mai vechi timpuri. Prin urmare, pentru a face ciuperci aceeași cultură gestionabilă ca cerealele, legumele, fructele, a fost mult timp o sarcină urgentă. Ciupercile care distrug lemnul sunt cel mai ușor susceptibile de cultivare artificială. Acest lucru se datorează particularităților biologiei lor, care ne-au devenit cunoscute și de înțeles abia acum. Capacitatea lor de a crește și de a da roade cu ușurință a fost folosită din cele mai vechi timpuri.

Cultivarea artificială a ciupercilor care distrug lemnul a devenit destul de răspândită. Miceliul ciupercilor comestibile poate fi cultivat pe medii lichide, precum zerul etc., în fermentatoare speciale, în așa-numita cultură profundă.

5. Protozoare

Protozoarele sunt printre obiectele netradiționale ale biotehnologiei. Până de curând, acestea erau folosite doar ca componentă a nămolului activ în tratarea biologică a apelor uzate. În prezent, acestea au atras atenția cercetătorilor ca producători de substanțe biologic active.

În această calitate, este mai rațional să se utilizeze protozoare cu viață liberă, care au o varietate de capacități biosintetice și, prin urmare, sunt larg distribuite în natură.

O nișă ecologică deosebită o ocupă protozoarele care trăiesc în rumenul rumegătoarelor. Au enzima celulaza, care favorizează descompunerea fibrelor în stomacul rumegătoarelor. Protozoarele din rumen pot fi o sursă a acestei enzime valoroase. Agentul cauzal al tripanosomiazei sud-americane este Tripanosomul (Schizotrypanum cruzi) a devenit primul producător de crucină (URSS) și analogul său, tripanoza (Franța). Studiind mecanismul de acțiune al acestor medicamente, oamenii de știință au ajuns la concluzia că aceste medicamente au un efect citotoxic în contact direct cu tumora și o inhibă indirect, prin stimularea sistemului reticuloendotelial. S-a dovedit că efectul inhibitor este asociat cu fracțiunile de acizi grași. O trăsătură caracteristică a acestor organisme este conținutul ridicat de acizi grași nesaturați, care în tripanosomide este de 70-80%, iar în Astasia longa(flagelat cu viață liberă) - 60% din totalul acizilor grași. În flagelati, fosfolipidele și acizii grași polinesaturați au aceeași compoziție și structură ca la oameni și animale. În lumea microbilor, acizii grași polinesaturați nu sunt sintetizați, iar animalele sau plantele pluricelulare reprezintă o bază de resurse mai limitată decât protozoarele, ale căror culturi pot fi obținute prin biotehnologie, indiferent de anotimp sau de condițiile climatice.

Deoarece metabolismul lipidic al protozoarelor are o relativă labilitate, au fost studiate modalitățile de reglare a acestuia. Aplicarea la protozoare a metodei general acceptate în microbiologie de creștere a biosintezei lipidelor prin reducerea conținutului sursei de azot în mediu și creșterea conținutului sursei de carbon a condus la o inhibare bruscă sau la oprirea creșterii culturilor. Pentru a crea condiții pentru biosinteza țintită a lipidelor, precursori și stimulatori ai biosintezei lipidelor au fost adăugați în medii pentru cultivarea flagelaților: malonat, citrat, succinat, nucleotide citidină în combinație cu un anumit regim de aerare.

Un alt grup de substanțe biologic active ale protozoarelor sunt polizaharidele. Varietatea polizaharidelor sintetizate de protozoare este destul de mare. De interes deosebit este paramilonul, care este caracteristic flagelaților euglenoizi. Reprezentanții genului Astasia și Euglena sunt capabili de supersinteza paramilonului, constituind peste 50% din reziduul uscat al celulelor. Această polizaharidă este studiată ca stimulent al sistemului imunitar al mamiferelor. Paramylon, izolat din A. longa, este practic netoxic. Efectul imunomodulator pronunțat și toxicitatea scăzută a acestui medicament sunt o condiție prealabilă pentru studiul său aprofundat în combinație cu medicamente antitumorale directe, radioterapie și alți adjuvanți.

În prezent, lumea acordă o mare importanță producției de glucani nu numai în scopuri medicale, ci și pentru industria alimentară și textilă. Până acum, glucanii au fost obținuți din culturi de bacterii sau alge. Euglenidele sunt una dintre cele mai promițătoare surse ale acestei substanțe. Polizaharidele structurale care alcătuiesc membranele celulare ale protozoarelor sunt heteropolizaharide care conțin glucoză, manoză, xiloză, arabinoză, riboză, galactoză, ramnoză, fructoză și glucozamină. Cele mai caracteristice heteropolizaharide sunt arabinogalactanii, D-galacto-D-mananul, fosfanoglucanii și altele.

Biomasa protozoarelor conține până la 50% proteine. Valoarea sa biologică ridicată constă în faptul că conține toți aminoacizii esențiali, iar conținutul de aminoacizi liberi este cu un ordin de mărime mai mare decât în ​​biomasa de microalge, bacterii și carne. Acest lucru indică posibilitățile largi de utilizare a protozoarelor cu viață liberă ca sursă de proteine ​​furajere.

6. Algele

Algele sunt folosite în principal pentru producerea de proteine. Foarte promițătoare în acest sens sunt culturile de alge unicelulare, în special, tulpinile foarte productive ale genului. Chlorella și scenedesmus. Biomasa lor, după o prelucrare adecvată, este utilizată ca aditiv în dietele animalelor, precum și în scopuri alimentare.

Algele unicelulare sunt cultivate într-un climat blând și cald (Asia Centrală, Crimeea) în bazine deschise cu un mediu nutritiv special. De exemplu, în perioada caldă a anului (6-8 luni) puteți obține 50-60 de tone de biomasă de chlorella la 1 ha, în timp ce una dintre cele mai productive ierburi, lucerna, dă doar 15-20 de tone de recoltă din aceeași zonă.

Chlorella conține aproximativ 50% proteine, în timp ce lucerna doar 18%. În general, în ceea ce privește 1 ha, chlorella formează 20-30 de tone de proteine ​​pure, iar lucerna - 2-3,5 tone.În plus, chlorella conține 40% carbohidrați, 7-10% grăsimi, vitaminele A (de 20 de ori mai multe), B2, K, PP și multe oligoelemente. Prin variarea compoziției mediului nutritiv, este posibilă deplasarea proceselor de biosinteză în celulele chlorellei către acumularea fie de proteine, fie de carbohidrați și, de asemenea, să se activeze formarea anumitor vitamine.

Cel puțin 100 de specii de alge macrofite sunt consumate în Europa și America, și mai ales în Est. Din ele se prepară multe feluri de mâncare diferite, inclusiv cele dietetice, salate, condimente. Se servesc sub forma de bucati confiate, fel de dulciuri, se fac dulceata, jeleu, aditivi pentru aluat si multe altele. În magazin puteți cumpăra alge marine conservate - alge din Orientul Îndepărtat sau din mările nordice. Se păstrează cu carne, pește, legume, orez, folosit la prepararea supelor etc. Alături de microalgele chlorella, este cea mai populară alge comestibile și furajere.

Mai sunt cunoscute și alte alge macrofite comestibile - ulva, din care se fac diverse salate verzi, precum și alaria, porphyra, rhodimenia, chondrus, undaria etc. În Japonia, produsele obținute din alge se numesc „kombu”, iar pentru a faceți-le să gătească gustoase, există mai mult de o duzină de moduri.

Într-un număr de țări, algele sunt folosite ca supliment de vitamine foarte util pentru hrănirea animalelor de fermă. Se adaugă în fân sau se administrează ca hrană independentă pentru vaci, cai, oi, capre, păsări de curte în Franța, Scoția, Suedia, Norvegia, Islanda, Japonia, America, Danemarca și nordul nostru. De asemenea, animalele sunt hrănite sub formă de suplimente cu biomasa microalgelor cultivate (chlorella, scenedesmus, dunaliella etc.).

Hidrolizate proteice de alge verzi scenedesmus utilizat în medicină și industria cosmetică. Experimentele cu alge verzi unicelulare sunt efectuate la fabricile pilot din Israel Dunaliella bardaw il, care sintetizează glicerol. Această algă aparține clasei de izoflagelate și este similară cu chlamydomonas. Dunadiella poate crește și se reproduce într-un mediu cu o gamă largă de conținut de sare: atât în ​​apa oceanelor, cât și în soluțiile de sare aproape saturate ale Mării Moarte. Acumulează glicerol liber pentru a contracara efectele adverse ale concentrațiilor mari de sare din mediul în care crește. În condiții optime și conținut ridicat de sare, glicerolul reprezintă până la 85% din masa uscată a celulelor. Aceste alge au nevoie de apă de mare, dioxid de carbon și lumina soarelui pentru a crește. După procesare, aceste alge pot fi folosite ca hrană pentru animale, deoarece nu au peretele celular indigerabil găsit la alte alge. De asemenea, conțin cantități semnificative de β-caroten. Astfel, prin cultivarea acestei alge se poate obtine glicerol, pigment si proteine, ceea ce este foarte promitator din punct de vedere economic.

Alături de furaje, algele au fost mult timp folosite în agricultură ca îngrășăminte. Biomasa îmbogățește solul cu fosfor, potasiu, iod și o cantitate semnificativă de microelemente și, de asemenea, își completează microflora bacteriană, inclusiv fixatoare de azot. În același timp, algele se descompun în sol mai repede decât îngrășămintele de gunoi de grajd și nu le înfundă cu semințe de buruieni, larve de insecte dăunătoare și spori de ciuperci fitopatogeni.

Unul dintre cele mai valoroase produse obținute din algele roșii este agarul, o polizaharidă prezentă în cojile lor și constând din agaroză și agaropectină. Cantitatea sa ajunge la 30-40% din greutatea algelor (alge Laurentia si Gracilaria, Gelidium). Algele sunt singura sursă de agar, agaroizi, caragenină, alginați.

Algele brune sunt singura sursă de obținere a uneia dintre cele mai valoroase substanțe ale algelor - sărurile acidului alginic, alginații. Acidul alginic este o heteropolizaharidă liniară construită din reziduuri legate (acizi 3-D-manuronic și α-L-hialuronic).

Alginații sunt utilizați în economia națională. Aceasta este producția de lubrifianți de înaltă calitate pentru frecarea pieselor de mașini, unguente și creme medicale și parfumate, fibre sintetice și materiale plastice, vopsea și acoperiri de lac rezistente la orice vreme, țesături care nu se estompează în timp, producția de mătase, adezivi de acțiune excepțional de puternică, materiale de construcție, produse alimentare de calitate excelentă – sucuri de fructe, conserve, înghețată, stabilizatori de soluție, brichetare combustibil, turnătorie și multe altele. Alginatul de sodiu este capabil să absoarbă până la 300 de unități de greutate de apă, formând în același timp soluții vâscoase.

Algele brune sunt, de asemenea, bogate într-un compus foarte util - alcoolul hexahidric manitol, care este utilizat în industria alimentară, farmaceutică, în producția de hârtie, vopsele, explozivi etc. Algele brune sunt planificate pentru a fi utilizate pentru a produce biogaz în viitorul apropiat. Culturile de calus de alge macrofite pot fi utilizate în continuare în diferite direcții. În cazul în care sunt obținute din agarofite, agarul poate fi obținut direct de la acestea. Culturile de calus de alge macrofite alimentare, de exemplu, alge, pot fi folosite în viitor pentru a obține proteine ​​care sunt utilizate direct în alimente și aditivi alimentari, precum și în hrana animalelor de fermă.

7. Plante

Plantele superioare (circa 300.000 de specii) sunt organisme pluricelulare diferențiate, predominant terestre. În procesul de diferențiere și specializare, celulele vegetale au fost grupate în țesuturi (simple - din celule de același tip și complexe - din diferite tipuri de celule). Țesuturile, în funcție de funcție, sunt împărțite în educaționale, sau meristeme (din grecescul meristos - divizibil), tegumentare, conductoare, mecanice, de bază, secretoare (excretoare). Dintre toate țesuturile, numai cele meristematice sunt capabile să se divizeze, iar toate celelalte țesuturi se formează pe cheltuiala lor. Acest lucru este important de obținut celule, care apoi trebuie incluse în procesul biotehnologic.

Celulele meristeme care persistă în stadiul embrionar de dezvoltare de-a lungul vieții plantei sunt numite inițiale, altele se diferențiază treptat și se transformă în celule din diferite țesuturi permanente - celule finale. Orice fel de plantă poate produce, în condiții adecvate, o masă neorganizată de celule în diviziune - calus(din latinescul callus - porumb), mai ales cu efectul inductor al hormonilor vegetali. Producția în masă de cali cu regenerare suplimentară a lăstarilor este potrivită pentru producția de plante la scară largă. În general, calusul este principalul tip de celule vegetale cultivate pe un mediu nutritiv. Țesutul calus de la orice plantă poate fi recultivat pentru o lungă perioadă de timp. În același timp, plantele originale (inclusiv cele meristematice) se dediferențiază și se despecializează, dar sunt induse să se divizeze, formând calusul primar.

Pe lângă creșterea calilor, este posibil să se cultive celule ale unor plante în culturi în suspensie.

Protoplastele celulelor vegetale par, de asemenea, a fi obiecte biologice importante. Metodele de preparare a acestora sunt fundamental similare cu metodele de obținere a protoplastelor bacteriene și fungice.

Pe lângă cultura de celule vegetale, se folosește ferigă acvatică Azolla. Este apreciat ca îngrășământ organic cu azot, deoarece crește în strânsă simbioză cu algele albastre-verzi anabaena. Acest lucru permite organismului simbiotic anaben-azolla să acumuleze mult azot în masa vegetativă. Anabenu Azolla se cultivă în câmpurile de orez înainte de însămânțarea orezului, ceea ce reduce cantitatea de îngrășăminte minerale aplicate.

Reprezentanți ai familiei linte de rață (Lemnaceae)- cele mai mici și mai simple ca structură plante cu flori, a căror dimensiune depășește rar 1 cm.Lingile de rață sunt plante plutitoare acvatice cu viață liberă. Corpul vegetativ seamănă cu o frunză sau un talus al plantelor inferioare, prin urmare, până la începutul secolului al XVIII-lea, lintia de rață a fost clasificată ca plantă de talus.

linte de rață ( Lemna minor, L. trisulca, Wolfia, Spirodela polyrhiza) servesc drept hrană pentru animale, rațe și alte păsări de apă, pești și șobolani muschi. Sunt folosite atât proaspete, cât și uscate ca hrană proteică valoroasă pentru porci și păsări de curte. Lentia de rață conține multe proteine ​​(până la 45% din greutatea uscată). 45% carbohidrați, 5% grăsimi și restul fibre etc. Sunt foarte productivi, nepretențioși în cultură, purifică bine apa și o îmbogățesc cu oxigen. Acest lucru face din linte de rață un obiect valoros pentru studii morfogenetice, fiziologice și biochimice.

8. Animale

Animalele în sine și culturile de celule animale pot fi folosite ca obiecte ale biotehnologiei.

În ciuda tuturor diferențelor dintre tipurile de eucariote, abordările metodologice ale cultivării celulelor de insecte, plante și mamifere au multe în comun. În primul rând, o mică bucată de țesut a unui anumit organism este luată și tratată cu enzime proteolitice care descompun proteinele materialului intercelular (când se lucrează cu celulele vegetale, se adaugă enzime speciale care distrug peretele celular). Celulele eliberate sunt plasate într-un mediu nutritiv complex care conține aminoacizi, antibiotice, vitamine, săruri, glucoză și factori de creștere. În aceste condiții, celulele se divid până când se formează un monostrat celular pe pereții recipientului de cultură. Dacă după aceea celulele nu sunt transferate în recipiente cu mediu nutritiv proaspăt, atunci creșterea se va opri. De obicei, este posibil să se transfere (transplant, subcultivare) și să se mențină până la 50-100 de generații de celule ale culturii celulare inițiale (primare), apoi celulele încep să-și piardă capacitatea de a se diviza și de a muri. Celulele cultivate păstrează unele dintre proprietățile materialului celular original, astfel încât acestea pot fi folosite pentru a studia proprietățile biochimice ale diferitelor țesuturi.

Adesea, unele dintre celulele din culturile de celule primare transplantate suferă modificări genetice care accelerează creșterea lor. Culturile celulare care dobândesc avantaje selective în acest fel sunt capabile de creștere nelimitată in vitro și sunt numite linii celulare rezistente. Unele linii celulare păstrează proprietățile biochimice de bază ale celulelor originale, în timp ce altele nu. Majoritatea celulelor capabile de creștere nelimitată au modificări cromozomiale semnificative, în special, există o creștere a numărului unor cromozomi și pierderea altora. În biotehnologia moleculară, liniile de celule animale rezistente sunt folosite pentru a propaga virusuri și pentru a identifica proteinele codificate de secvențe de ADN donate. În plus, ele sunt utilizate pentru producția pe scară largă de vaccinuri și proteine ​​recombinante.

9. Cerințe pentru obiectele biologice

Pentru implementarea proceselor biotehnologice, parametri importanți ai obiectelor biologice sunt: ​​puritatea, rata de reproducere celulară și reproducere a particulelor virale, activitatea și stabilitatea biomoleculelor sau biosistemelor.

Trebuie avut în vedere că atunci când se creează condiții favorabile pentru un obiect biologic selectat al biotehnologiei, aceleași condiții se pot dovedi a fi favorabile, de exemplu, pentru microbi - contaminanți sau poluanți. Reprezentanții microflorei contaminante sunt virușii, bacteriile și ciupercile găsite în culturile de celule vegetale sau animale. În aceste cazuri, microbii-contaminanții acționează ca dăunători ai producției în biotehnologie. Când se utilizează enzime ca biocatalizatori, devine necesară protejarea lor în stare izolată sau imobilizată de distrugerea de către microflora saprofită banală (nu patogenă), care poate pătrunde în procesul biotehnologic din exterior datorită nesterilității sistemului.

Activitatea și stabilitatea în starea activă a obiectelor biologice sunt unul dintre cei mai importanți indicatori ai adecvării lor pentru utilizarea pe termen lung în biotehnologie.

Astfel, indiferent de poziția sistematică a obiectului biologic, în practică se folosesc fie particule naturale organizate (fagi, viruși) și celule cu informații genetice naturale, fie celule cu informații genetice date artificial, adică, în orice caz, celulele sunt utilizat, fie că este vorba despre un microorganism, o plantă, un animal sau o persoană. De exemplu, putem numi procesul de obținere a virusului poliomielitei pe o cultură de celule de rinichi de maimuță pentru a crea un vaccin împotriva acestei boli periculoase. Deși ne interesează aici acumularea virusului, reproducerea acestuia are loc în celulele organismului animal. Un alt exemplu este cu enzimele care urmează să fie utilizate în stare imobilizată. Sursa enzimelor o constituie și celulele izolate sau asociațiile lor specializate sub formă de țesuturi, din care sunt izolați biocatalizatorii necesari.



În natură, există un număr mare de microorganisme care sunt capabile să sintetizeze produse sau să efectueze reacții care pot fi utile pentru biotehnologie. Cu toate acestea, nu mai mult de 100 de tipuri de microorganisme (bacterii, ciuperci, drojdie, viruși, alge) și-au găsit aplicație practică.

Drojdia este utilizată pe scară largă în coacere, fabricare a berii, vinificație, obținerea de sucuri, proteine ​​furajere, medii nutritive pentru creșterea bacteriilor și a culturilor de celule animale. Din cele 500 de specii de drojdie cunoscute, sunt folosite doar câteva specii - Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Printre bacterii reprezentanții următoarelor genuri sunt cel mai des utilizați în biotehnologie: Acetobacter, care transformă etanolul în acid acetic și acid aceticîn dioxid de carbon și apă; Bacil - pentru a obține enzime (B. subtilis), produse de protecție a plantelor (B. thuringiensis); Clostridium - pentru fermentarea zaharurilor în acetonă, etanol, butanol; Pseudomonas - de exemplu, P. Denitrificans - pentru a obține vitamina B 12, Corynebacterium glutamatum - pentru a obține aminoacizi etc.

Pentru a obține o varietate de antibiotice în biotehnologie, se folosesc actinomicete (genul Streptomyces), ciuperci din genul Penicillium etc.

Multe microorganisme - bacterii, drojdii, virusuri - sunt folosite ca destinatari ai materialului genetic străinîn vederea obţinerii de tulpini recombinante-producători de produse biotehnologice. Au fost obținute tulpini recombinante de E. coli producătoare de interferoni, insulină, hormon de creștere și antigene ale virusului SIDA; tulpini de B. subtilis producătoare de interferon; tulpini de drojdie producătoare de interleukină-2, antigen al virusului hepatitei B; virusuri vaccinale recombinante care sintetizează antigene ale hepatitei B, virusului rabiei, encefalitei transmise de căpușe etc.

Microorganismele patogene (tifoidă, tuse convulsivă, difterie, tetanos etc.) sunt, de asemenea, utilizate pentru obținerea vaccinurilor și a preparatelor pentru diagnostic.

utilizat pe scară largă în biotehnologie culturi de celule animale si vegetale. Se știe că structura, fiziologia și biotehnologia celulelor animale și vegetale sunt mai complexe decât cele ale celulelor bacteriene. Din culturi de celule animale și vegetale, poate fi extrasă o gamă mai largă de produse complexe de reacție în lanț, dar procesul de cultivare celule vegetale si animale mai laborios si mai costisitor. Culturile de țesuturi vegetale pot fi folosite pentru a obține o varietate de compuși utilizați în medicină (alcaloizi, substanțe antiinflamatoare, antileucemice și antitumorale, antibacteriene, agenți cardiaci și renali, enzime, vitamine, opiacee etc.), agricultură, chimie și alte industrii . Celulele animale sunt folosite atat pentru producerea de produse cat si pentru cresterea virusurilor in celule in vederea obtinerii de vaccinuri si preparate de diagnostic din acestea.

Astfel, în producția biotehnologică modernă se utilizează o gamă foarte largă de obiecte biologice, a căror clasificare este foarte complexă și poate fi realizată cel mai rațional pe baza principiul proporţionalităţii lor. Tabelul prezintă obiecte biologice combinate în 5 grupe, iar proporționalitatea în primele patru are o multiplicitate de trei ordine, iar doar în a cincea grupă sunt colectate obiecte biologice care diferă ca mărime de grupa precedentă (a patra) doar printr-o singură ordine.

Bioobiecte utilizate în metodele biotehnologice pentru producerea de agenți medicinali (diagnostici, terapeutici și profilactici):

Cerințe pentru obiectele biologice pentru implementarea proceselor biotehnologice: puritate, rata mare de reproducere celulară și reproducere a particulelor virale, activitatea și stabilitatea biomoleculelor sau biosistemelor.

Termeni și concepte de bază ale biotehnologiei:

Acizi nucleici - compuși organici cu complexitate moleculară mare, formați dintr-o serie de componente ale unei structuri mai simple, numite nucleotide.

nucleotide - este un complex care include una dintre bazele azotate, un carbohidrat (riboză sau dezoxiriboză) și un reziduu de acid fosforic.

ADN (acizi dezoxiribonucleici) - acizi nucleici care conțin deoxiriboză ca componentă de carbohidrați și adenină, guanină, citozină, timină ca baze azotate. ADN-ul este prezent în celulele oricărui organism, face parte din mulți virusuri. Structura primară a moleculei de ADN este strict individuală și specifică; este o formă de cod pentru înregistrarea informațiilor biologice, de exemplu. cod genetic.

ARN (acizi ribonucleici) - acizi nucleici care conțin riboză ca componentă carbohidrată și adenină, guanină, citozină, uracil ca baze azotate. ARN-ul este prezent în celulele oricărui organism viu, face parte din mulți virusuri; participa la implementarea informațiilor genetice.

gena - factor ereditar, informație indivizibilă funcțional a materialului genetic; o secțiune a unei molecule de ADN care codifică structura primară a unei polipeptide, molecule de transport și ARN ribozomal sau care interacționează cu o proteină reglatoare.

genotip - totalitatea genelor unei celule sau organism dat.

Genomul - un set de gene caracteristic setului haploid de cromozomi ai unui anumit tip de organism; setul principal de cromozomi haploid.

Vector - orice plasmidă sau fag în care poate fi inserată o moleculă străină de ADN în scopul clonării.

plasmidă - ADN circular extracromozomial capabil de replicare autonomă.

Replicare - autoduplicarea unei molecule de ADN prin formarea copiei acesteia folosind un set de enzime (ADN polimeraze, ligaze etc.).

Hibridare - procesul de formare sau producere a hibrizilor, care se bazează pe combinarea materialului genetic al diferitelor celule dintr-o celulă.

Clonare - un set de celule sau indivizi descendenți dintr-un strămoș comun prin reproducere asexuată.

Încordare - o cultură pură a unui microorganism izolat dintr-o sursă specifică sau rezultată din mutații.

eucariote - organisme formate din celule, care conțin în mod necesar un organel special - nucleul.